[发明专利]负载间充质干细胞的复合纳米纤维敷料的制备方法及其产品和应用

摘要

本发明涉及一种负载间充质干细胞的复合纳米纤维敷料的制备方法及其产品和应用，包括丝素蛋白的提取、纳米羟基磷灰石的制备、有机无机复合纳米纤维膜的制备和负载间充质干细胞的复合纳米纤维敷料的制备。该敷料具有良好的组织修复效果，且制备方法简便易行，能够满足生物医学应用的需求。本发明所使用的间充质干细胞具有较强的增殖、分化能力，且取材方便，同时不存在社会伦理争议。本发明制备的复合纳米纤维具有良好的生物相容性、力学性能以及可控的降解性能，能够作为基底材料支持干细胞的生长，同时对干细胞分化起到诱导与调控作用，促进新组织的生成。本发明制备的生物敷料具有良好的组织修复效果，能够促进骨缺损部位的快速愈合。

主权项

一种负载间充质干细胞的复合纳米纤维敷料的制备方法，其特征在于，将丝素蛋白、聚消旋乳酸‑聚己内酯共聚物以及羟基磷灰石进行混合后，溶解于溶剂中，利用静电纺丝技术制备复合纳米纤维，然后进行干细胞接种，得到负载间充质干细胞的复合纳米纤维敷料，包括以下步骤：(1) 丝素蛋白的提取称取10 g的无水碳酸钠，溶解于2 L超纯水中，配制成5 g/L的Na2CO3水溶液，将20 g家蚕生丝置于其中，加热煮沸30 min，取出蚕丝，用大量超纯水进行冲洗，同时充分撕扯蚕丝以冲去其间的丝胶，更换新的碳酸钠溶液，重复一次煮沸与清洗过程，将脱胶后的蚕丝置于鼓风干燥箱中在60 °C条件下过夜；配制摩尔比为1:8:2的氯化钙/超纯水/乙醇三元溶剂，先将CaCl2加入超纯水中，加热至80 °C，待其全部溶解后加入乙醇，将烘干后的蚕丝按一定的比例分块投入三元溶剂中，蚕丝与溶剂的比例为10% (w/v)，80 °C条件下溶解后搅拌40 min；待丝素溶液冷却至室温后，将其倒入透析袋中，在流动的超纯水中透析三天，以除去溶液中的无机盐和乙醇，将透析后的溶液进行抽滤，过滤掉不溶性杂质，将溶液置于‑80 °C超低温冰箱中过夜，然后在冻干机中冻干，得到固态的SF粉；(2) 纳米羟基磷灰石的制备配制500 mL 0.5 M的Ca(NO3)2溶液和300 mL 0.5 M的(NH4)2HPO4溶液，将50 mL浓氨水用Milli‑Q超纯水稀释至500 mL，将Ca(NO3)2溶液加入三口烧瓶中，在室温下用蠕动泵滴加(NH4)2HPO4溶液并控制滴加速率为3 mL/min，同时以5 mL/min的速率滴加氨水，保持混合溶液的pH值在9.5与10之间，一边滴加一边以500 rpm的转速进行磁力搅拌，滴加完毕后，继续磁力搅拌5 h，然后静置陈化24 h；弃去上层清液，用1 L无水乙醇进行淋洗和抽滤，然后用大量超纯水进行反复清洗和抽滤，直至滤液为中性，水洗结束后，再次用乙醇进行分散和抽滤，将滤渣置于60 ° C烘箱中干燥，干燥后的固体在红外灯下用研钵研碎，以150目筛网过筛，得到HAp的前驱体；将前驱体置于马弗炉中煅烧，首先在100 min内升温至500 °C并维持5 min，然后在100 min内继续升温至1000 °C并维持180 min，煅烧后的产物置于球磨机中，放置大球20 g和小球40 g，在400 rpm的转速下球磨15 h，在15 °C下以5000 rpm的转速离心10 min，然后用旋转蒸发仪在45 °C下将溶剂蒸干，在60 °C下烘干，干燥后的HAp产物用研钵研碎，并干燥保存备用；(3) 有机无机复合纳米纤维膜的制备分别称取一定量的SF、P(DLLA‑co‑CL)与HAp，按一定的比例混合后加入特定的溶剂中，超声分散并搅拌24 h以上，得到均一稳定的SF/P(DLLA‑co‑CL)/HAp纺丝分散液，将分散液缓慢吸入10 mL玻璃注射器中，在一定的正负极电压与液体流速下进行静电纺丝，纺丝结束后，从滚筒接收装置表面小心揭下纤维膜，并置于真空干燥箱中干燥48 h，得到SF/P(DLLA‑co‑CL)/HAp复合纳米纤维膜；(4) 负载间充质干细胞的复合纳米纤维敷料的制备将复合纳米纤维膜剪成所需的大小和形状，放入细胞培养板或细胞培养皿表面，用75%乙醇浸泡材料45 min以灭菌，然后用PBS漂洗材料6次，每次30 min，确保材料中的乙醇被除尽；（5）取对数期生长的状态良好的MSC，以一定的细胞密度接种于复合膜表面，在含有胎牛血清与青霉素/链霉素的培养基中培养24 h，即得到负载MSC的SF/P(DLLA‑co‑CL)/HAp复合纳米纤维敷料。