[发明专利]负载间充质干细胞的复合纳米纤维敷料的制备方法及其产品和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种负载间充质干细胞的复合纳米纤维敷料的制备方法及其产品和应用，具体涉及一种利用静电纺丝技术制备有机无机复合纳米纤维膜材料，然后在材料表面负载间充质干细胞，形成具有潜在医用价值的生物敷料的方法。本发明属于纳米生物材料以及干细胞领域。

背景技术

生物材料经历了由完全生物惰性到具有生物活性、由不可降解到生物可降解的发展过程，如今已经发展到第三代。单一的生物材料大多具有两面性，即拥有各自优点的同时，在材料的应用中也存在着一定的弊端。天然生物大分子的生物相容性好，但往往力学强度较低，且降解速率较快；合成聚合物具有较高的力学强度与可控的降解速率，但细胞相容性与细胞响应性的欠缺会阻碍其进一步发展；无机生物材料力学性能好，但大多无法降解。因此，具有可控生物活性与生物降解性的复合材料将是新型生物材料发展的主流趋势。

在组织工程与再生医学领域，除了生物材料之外，种子细胞也是极为关键的一个要素。近年来，由于具有高度自我更新与诱导分化潜能，基于干细胞的基础研究与临床应用的发展日新月异。鉴于胚胎干细胞存在着严重的伦理道德问题，相比而言，另一种多能干细胞——间充质干细胞(MSC)已成为组织工程中的首选种子细胞。

一直以来，如何在体外实现缺损组织的快速且高效修复是困扰着材料学家和临床医生的一个难题。利用纳米技术与干细胞技术的结合，实现干细胞在纳米材料上的高效负载，制备纳米材料-干细胞复合体，为组织修复提供了一个新思路。因此，将间充质干细胞负载于复合纳米生物材料中，开发新型生物敷料，对于促进缺损组织的快速修复与增强组织修复效果都具有重要的意义。

发明内容

针对单一材料存在的性能缺陷以及胚胎干细胞存在的伦理问题，本发明的目的在于：提供一种负载间充质干细胞的复合纳米纤维敷料的制备方法。可以将天然高分子、合成高分子、无机材料以及间充质干细胞等因素结合起来。

本发明的再一目的在于：提供一种上述方法制备的产品。

本发明的又一目的在于：提供一种上述产品的应用。

本发明目的通过下述方案实现：一种负载间充质干细胞的复合纳米纤维敷料的制备方法，将丝素蛋白、聚消旋乳酸-聚己内酯共聚物以及羟基磷灰石进行混合后，溶解于溶剂中，利用静电纺丝技术制备复合纳米纤维，然后进行干细胞接种，得到负载间充质干细胞的复合纳米纤维敷料，包括以下步骤：

(1) 丝素蛋白的提取

称取10 g的无水碳酸钠，溶解于2 L超纯水中，配制成5 g/L的Na₂CO₃水溶液，将20 g家蚕生丝置于其中，加热煮沸30 min，取出蚕丝，用大量超纯水进行冲洗，同时充分撕扯蚕丝以冲去其间的丝胶，更换新的碳酸钠溶液，重复一次煮沸与清洗过程，将脱胶后的蚕丝置于鼓风干燥箱中在60 °C条件下过夜；

配制摩尔比为1:8:2的氯化钙/超纯水/乙醇三元溶剂，先将CaCl₂加入超纯水中，加热至80 °C，待其全部溶解后加入乙醇，将烘干后的蚕丝按一定的比例分块投入三元溶剂中，蚕丝与溶剂的比例为10% (w/v)，80 °C条件下溶解后搅拌40 min；

待丝素溶液冷却至室温后，将其倒入透析袋中，在流动的超纯水中透析三天，以除去溶液中的无机盐和乙醇，将透析后的溶液进行抽滤，过滤掉不溶性杂质，将溶液置于-80 °C超低温冰箱中过夜，然后在冻干机中冻干，得到固态的SF粉；

(2) 纳米羟基磷灰石的制备

配制500 mL 0.5 M的Ca(NO₃)₂溶液和300 mL 0.5 M的(NH₄)₂HPO₄溶液，将50 mL浓氨水用Milli-Q超纯水稀释至500 mL，将Ca(NO₃)₂溶液加入三口烧瓶中，在室温下用蠕动泵滴加(NH₄)₂HPO₄溶液并控制滴加速率为3 mL/min，同时以5 mL/min的速率滴加氨水，保持混合溶液的pH值在9.5与10之间，一边滴加一边以500 rpm的转速进行磁力搅拌，滴加完毕后，继续磁力搅拌5 h，然后静置陈化24 h；