[发明专利]一种快速筛查与确证牛奶中兽药残留的方法

摘要

本发明公开了一种筛查牛奶中兽药残留的方法，样品经5%甲酸乙腈提取，QuEChERS EMR‑Lipid技术净化，LC‑QTOF筛查与确证。建立了134种药物的一级筛查谱库，对其中40中常用兽药进行了方法学验证，方法的灵敏度、准确性和重复性良好。对实际样品进行一级谱库扫描，对发现的兽药残留通过二级质谱解析进一步确证，最终采用标准物质进行验证。该法能发现日常检测难以发现的问题，满足评估和监管牛奶中的药物残留的要求。

主权项

一种快速筛查与确证牛奶中兽药残留的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S1 一级筛查库建立根据农业部235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》、国内外兽药使用和残留限量的相关标准，确定了134种常用药物进行筛查，分别为：乙酸丙嗪、阿苯达唑砜、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑、阿苯达唑氨砜、四烯雌酮、金刚烷胺、羟氨苄青霉素、羟氨苄青霉噻唑酸、去羟基氨苄青霉噻唑酸、氨苄青霉素、氨苄青霉噻唑酸、去羟氨苄青霉噻唑酸、去甲雄三烯醇酮、阿托品、阿扎哌隆、阿奇霉素、坎苯达唑、咔唑心安、头孢氨苄、头孢匹林、头孢唑啉、头孢匹罗、头孢喹肟、头孢洛宁、金霉素、氯丙嗪、西诺沙星、环丙沙星、克仑特罗、克仑塞罗、克仑潘特、克林霉素、邻氯青霉素、氯唑西林、邻氯青霉噻唑酸、去羟邻氯青霉噻唑酸、达氟沙星、地美环素、地塞米松、地西泮、双氯西林、二氟沙星、强力霉素、氟哌利多、红霉素、泛昔洛韦、非班太尔、芬苯哒唑、氟罗沙星、氟苯达唑氨基代谢产物、氟甲哇、氟轻松、依诺沙星、恩诺沙星、氟哌啶醇、异丙硝唑、交沙霉素、洛美沙星、马普特罗、马喷特罗、麻保沙星、甲苯哒唑、甲苯哒唑羟基代谢产物、甲苯哒唑氨基代谢产物、甲地孕酮、美仑孕酮乙酸酯、甲硝唑、甲基强的松龙、萘夫西林、诺氟沙星、奥比沙星、奥芬达唑、奥苯达唑、氧氟沙星、苯唑西林、土霉素、喷布洛尔、苄青霉素、苄青霉噻唑酸、去羟苄青霉噻唑酸、奋乃静、培氟沙星、青霉素、毗呱酸、哌拉西林、泼尼松龙、孕酮、莱克多巴胺、班布特罗、倍氯米松、倍他米松、利巴韦林、罗红霉素、溴布特罗、沙拉沙星、司帕沙星、螺旋霉素、康力龙、苯甲酸磺胺、磺胺醋酸、磺胺喹恶琳、磺胺氯哒嗪、磺胺氯毗嗪、磺胺嘧啶、磺胺二甲氧嗪、周效磺胺、磺胺甲基嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲二唑、磺胺甲恶唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺苯吡唑、磺胺吡啶、柳氮磺胺吡啶、磺胺噻唑、磺胺二甲异嘧啶、磺胺二甲异唑、左旋咪唑、特硝唑、睾酮、四环素、噻苯咪唑、5‑羟基噻苯咪唑、泰妙菌素、替硝唑、群勃龙乙酸酯、甲氧苄啶、妥布特罗、泰乐菌素、甲苯噻嗪、赛拉嗪；S2 样品前处理精确称取牛奶样品5g（精确至0.01g）,于50mL具盖离心管中,加入10.0毫升5%甲酸乙腈提取液及两粒陶瓷均质子，涡旋（2000rpm）混匀5分钟，离心5min(4000rpm)，移取5.0毫升醋酸铵水溶液（5mM)到15毫升EMR‑Lipid dSPE管中，快速振摇并涡旋2分钟（2000rpm），移取5.0毫升离心后上层提取液到经过活化的EMR‑Lipid dSPE管中，快速振摇并涡旋2分钟（2000rpm），离心5min(4000rpm)，将上层液完全倾倒入50.0mL离心管中，加入两粒陶瓷均质子及EMR polish粉包，快速剧烈振摇并涡旋2分钟（2000rpm），离心5min(4000rpm)，移取上层乙腈液，待分析；S3色谱分离色谱仪:Agilent 1290 Infinity LC；色谱柱:ZORBAX Eclipse Plus C18(3.0 mm×100mm，1.8μm)；柱温:30℃；流速:0.4mL/min；进样体积:5μL；流动相:A:0.1%甲酸水，5mmol乙酸铵(ESI+)，B:甲醇，洗脱条件:0～1min，95%A，1～8min，95%～50%A，8～14min，50%～5%A，14～18min，5%～2%A，18～19.5min，2%～95%A，保持95%A 0.5min，等待下一次进样；S4 质谱检测质谱仪:Agilent 6530 Accurate‑Mass Q‑TOF；离子源:双喷射离子源Dual AJS ESI；雾化气:40psi；干燥气温度:325℃；干燥速率:7L/min；鞘气温度:350℃；鞘气流速:11L/min；毛细管电压:3500V；喷嘴电压:0V（ESI+）；碰撞解离电压:135V；扫描范围:100～1000m/z，二级质谱扫描范围和碰撞电压分别根据待测目标化合物设定；采集速率:一级1.5spectra/s，二级5spectra/s；S5方法学确证取空白纯牛奶样品，选取40种不同性质兽药进行方法学验证，按步骤S2所述的样品预处理方法进行处理净化，按步骤S3、S4所述的测定目标分析物相应强度，以分子离子峰面积Y对含量X(μg/L)作标准曲线，用基质提取液稀释标准曲线的最低浓度，直到获得每种兽药的信噪比等于10(S/N=10)的浓度，确定其为该化合物的定量限(LOQ)，在20、40和80μg/kg 3个添加水平下，在空白基质中添加40种常见兽药，进行筛查确证，每个浓度水平取6份样品进行试验，计算平均回收率及相对标准偏差(RSD)；S6样品测定S6.1 一级谱库扫描按步骤S2‑S4所述的上机测定目标分析物，利用建立的一级谱库，进行134种兽药残留的筛查，对样品中的化合物通过准分子离子的精确质量数、同位素分布和丰度等特征与数据库中的理论数据进行比对，筛查出可能存在的兽药残留；S6.2 二级质谱解析在安捷伦Mass Hunter Qualitative Analysis软件 Targeted MS/MS采集界面输入筛查出的兽药残留的母离子和保留时间，优化碰撞能量，得到丰富的二级离子和少量的母离子，通过分子结构解析软件Mass Hunter MSC进行结构分析，进一步确证化合物；S6.3 标准物质确证将1mg/L标准物质溶液注入液相色谱四级杆飞行时间质谱仪，采集一级质谱图，与样品进行比对，查看样品中的化合物与标准溶液中的化合物保留时间是否一致，准分子离子峰是否一致，进一步，以标准物质建立二级谱图，将样品中化合物的二级谱图与谱图库中标准物质的碎片离子谱图进行匹配，从而可以确定该物质；S6.4 定量测定取空白纯牛奶样品为基质，配置标准曲线，通过外标法，进行定量。