[发明专利]一种检测A549肿瘤细胞电化学传感器工作电极的制备方法

摘要

本发明涉及一种检测A549肿瘤细胞电化学感器工作电极的制备方法，该方法由对裸金电极进行抛光处理、滴涂捕获探针、封闭非特异性位点、滴涂燃料探针、制备Apt‑T双链复合物、往Apt‑T双链复合物中加入待测细胞液杂交、扩增并固定H1‑H2双链复合物和碱性磷酸酶处理8个步骤组成，其中所述的燃料探针的序列如SEQ ID NO.2所示。本发明所述的方法增设了在裸金电极表面滴涂所述燃料探针的步骤，因此可实现双向催化发夹自组装反应，显著提高了检测的灵敏度。

主权项

1.一种检测A549肿瘤细胞电化学感器工作电极的制备方法，该方法由以下步骤组成：（1）将裸金电极用0.5mm的氧化铝粉进行抛光处理，置于去离子水中超声10min，然后取出室温下晾干；（2）往经步骤（1）处理的裸金电极表面滴涂预先准备好的浓度为200nM的捕获探针10μL，4℃下放置12小时；其中所述捕获探针为， 5'‑SH‑（CH₂）₆ TTTAGTCCAGCGTAATCTACACAACATAAC ‑3'；（3）用Tris‑HCl缓冲液冲洗经步骤（2）处理的金电极，室温下晾干后滴加8μL浓度为 1mmol mL^‑1的6‑巯基己醇，放置1个小时，再用Tris‑HCl缓冲液冲洗，室温下晾干后滴加10μL 浓度为2%的胎牛血清蛋白，放置半个小时，以封闭非特异性位点；其中所述Tris‑HCl缓冲液的pH为 7.4并由Tris、NaCl、MgCl₂ 和去离子水组成，其中所述Tris、NaCl和MgCl₂的终浓度依次为：20 mmolL^‑1，100 mmolL^‑1和5 mmolL^‑1；（4）往经步骤（3）处理的金电极表面滴涂预先准备好的浓度为200nM的燃料探针10μL，放置半个小时；其中所述燃料探针为，5'‑GTTATGTTGTGTAGAAGGGTT ‑3'；（5）将20μL浓度为10μM的识别A549肿瘤细胞的适配体链Apt与10μL浓度为10μM的催化链T在EP管中混合，室温反应30min形成Apt‑T双链复合物； 其中，所述的适配体链序列为ACCCTAACCCTGCAGTTGATCCTTTGGATACCCTGG；所述的催化链的序列为，ATCAACTGCAGGGTTAGGGTTAGGGTT；（6）将所述Apt‑T双链复合物中加入待测细胞液，再加入结合缓冲液定容至1 ml，然后置于杂交仪，37℃下中速震动1h，1000 rpm离心15 min；其中所述结合缓冲液的pH为7.5并由Tris、NaCl、MgCl₂ 和去离子水组成，其中所述Tris、NaCl、MgCl₂的终浓度依次为：10 mmolL^‑1，500 mmolL^‑1 和1 mmolL^‑1；（7） 取离心后上清液40 μL与浓度为100nM的发夹 H1和H2各20μL混合，然后滴加到经步骤（4）处理的裸金电极上进行双重催化发夹自组装反应扩增，所得扩增产物H1‑H2双链复合物被捕获固定在所述工作电极的表面；其中，所述的发夹H1的序列为：AACCCTAACCCTAACCCTCCATGTGTAGAAGGGTTAGGGTT，且其3'端标记有生物素；所述的发夹H2的序列为：AACCCTTCTACACATGGAGGGTTAGGGTTCCATGTGTAGATTACGCTGGACT；（8）取10μL 浓度为0.00125g/ml的亲和素化的碱性磷酸酶滴加到经步骤（7）处理的金电极面上，25℃下温育30 min后用DEA缓冲液清洗，即得所述的工作电极；其中所述DEA缓冲液的pH 为9.6并由NaCl、MgCl₂、二乙醇胺和去离子水组成，其中所述NaCl、MgCl₂、二乙醇胺的终浓度依次为：100 mmolL^‑1，1 mmolL^‑1，0.1 molL^‑1。