[发明专利]一种检测A549肿瘤细胞电化学传感器工作电极的制备方法

说明书

本发明涉及一种检测A549肿瘤细胞电化学感器工作电极的制备方法，该方法由对裸金电极进行抛光处理、滴涂捕获探针、封闭非特异性位点、滴涂燃料探针、制备Apt‑T双链复合物、往Apt‑T双链复合物中加入待测细胞液杂交、扩增并固定H1‑H2双链复合物和碱性磷酸酶处理8个步骤组成，其中所述的燃料探针的序列如SEQ ID NO.2所示。本发明所述的方法增设了在裸金电极表面滴涂所述燃料探针的步骤，因此可实现双向催化发夹自组装反应，显著提高了检测的灵敏度。

技术领域

本发明涉及借助于测定材料的化学或物理性质来测试或分析材料，具体涉及通过测试电化学变量测试或分析肿瘤细胞。

背景技术

目前检测稀有肿瘤细胞的方法主要包括流式细胞术、免疫组化法、荧光原位杂交、微流控检测技术和二代测序等，这些方法不同程度地解决了肿瘤细胞检测的相关问题，但目前仍然缺乏一种适用于各实验室简便、快速、高灵敏、高特异的检测方法。流式细胞术具有高通量检测能力并能对多种肿瘤细胞进行定量和分选，然而昂贵的仪器和对操作及结果分析的人员专业性要求极高，限定了它的普及。近年来备受关注的用于循环肿瘤细胞检测的平台，是目前唯一获得FDA批准用于临床的循环肿瘤细胞检测平台。该平台利用抗体标记磁珠对细胞进行富集，并将细胞固定后用荧光染料和荧光抗体标记细胞后进行细胞鉴定。该技术能较好的保护细胞形态结构，利于观察肿瘤细胞形态，为肿瘤细胞检测提供了新思路，却仍存在标志物种类局限、假阴性率高和设备精密昂贵等不足。因此，为适应临床诊断治疗，特别是个体化诊断治疗的需求，从传感器着手，发展快速、简便、高灵敏、高特异的可用于血液、体液中肿瘤细胞检测的分析方法是当今生物传感研究领域一项亟待解决的课题，也是近年来研究热点之一。

电化学传感器由于选择性好、响应快、操作简单样品需用量少、样品需用量少、价格低廉等优点而应用到临床医学领域，并且在其基础上建立了各种扩增策略，用于灵敏检测A549肿瘤细胞，如滚环扩增(RCA)，环介等温扩增法(LAMP)，催化发夹组装(CHA)等。滚环扩增(RCA)灵敏度高，特异性较好，但耗时长，操作繁琐；环介等温扩增法(LAMP)一步反应，简便，但引物及长序列模板设计复杂；催化发夹组装(CHA)作为无酶扩增方法已经被证明在核酸扩增反应中信号放大是稳定和简单的，由于催化性能和非特异性背景信号，传统CHA的敏感性不符合临床样品中癌细胞检测的要求，为了进一步提高CHA对癌细胞检测的分析性能，本工作引入了一种燃料探针，提高了适体传感器的敏感性。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明所要解决的技术问题是提供一种检测A549肿瘤细胞电化学传感器工作电极的制备方法，该方法所得到的工作电极具有灵敏度高的优点。

本发明解决上述问题的技术方案如下。

一种检测A549肿瘤细胞电化学感器工作电极的制备方法，该方法由以下步骤组成：

(1)将裸金电极用0.5mm的氧化铝粉进行抛光处理，置于去离子水中超声10min，然后取出室温下晾干；

(2)往经步骤(1)处理的裸金电极表面滴涂预先准备好的浓度为200nM的捕获探针10μL，4℃下放置12小时；其中所述捕获探针为，5'-SH-(CH2)6TTTAGTCCAGCGTAATCTACACAACATAAC-3'(SEQ ID NO.1)；

(3)用Tris-HCl缓冲液冲洗经步骤(2)处理的金电极，室温下晾干后滴加8μL浓度为1mmol mL^-1的6-巯基己醇(MCH)，放置1个小时，再用Tris-HCl缓冲液冲洗，室温下晾干后滴加10μL浓度为2％的胎牛血清蛋白(BSA)，放置半个小时，以封闭非特异性位点；其中所述Tris-HCl缓冲液的pH为7.4并由Tris、Nacl、MgCl₂和去离子水组成，其中所述Tris、Nacl和MgCl₂的终浓度依次为：20mmolL^-1，100mmolL^-1和5mmolL^-1；