[发明专利]基于分子生物学技术的蛹虫草子囊孢子杂交育种方法

摘要

本发明涉及一种基于分子生物学技术的蛹虫草子囊孢子杂交育种方法，具体包括在无菌环境中诱导并分离蛹虫草单孢子并培养形成菌落；利用PCR技术对分离的单孢子形成的菌落进行交配型基因MAT1‑1‑1、MAT1‑1‑2和MAT1‑2‑1进行检测；选取含有交配型基因MAT1‑1‑1和MAT1‑1‑2却不含有MAT1‑2‑1的单孢子形成的菌落，与含有交配型基因MAT1‑2‑1却不含有MAT1‑1‑1和MAT1‑1‑2的单孢子形成的菌落分别取适当大小的菌丝体置于培养液中进行暗培养；将适当浓度的组合培养后的菌液接种到蛹虫草人工培养基，经过培养一段时间后，人工培养基上长出新品种的蛹虫草子实体。本方法培育的蛹虫草新品种更容易获得较好的产量以及子实体活性物质含量，通过统计不同组合培养出的子实体产量和活性物质含量，可以获得能稳定生产出优质蛹虫草子实体的组合，本方法周期较短，工作量较小，是一种高效的蛹虫草育种方法。

主权项

基于分子生物学技术的蛹虫草子囊孢子杂交育种方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）在无菌条件下，将新鲜、成熟的蛹虫草子实体悬于水琼脂培养基上方，避免子实体与培养基接触；所述蛹虫草子实体由常德炎帝生物科技有限公司的菌种库中大孢子头品种、小孢子头品种、尖头孢子粉品种中的一种培植出的；（2）将其转移至生化培养箱中，21℃避光培养4‑5天，使子囊孢子自然弹射到PDA培养基上；（3） 在体式显微镜下挑取只有单个子囊孢子的菌落，再加入2ml的无菌水，搅拌均匀，制备成孢子悬液，取200微升的孢子悬浮液，涂布PDA平板培养基上，放置于21℃生化培养箱中避光培养；(4)培养3‑4天后，在超净工作台上选取肉眼可见的子囊孢子单菌落，转移至新的PDA平板培养基上，每个PDA平板培养基上只培养单个菌落；(5) 培养5天后，取纯化的单个子囊孢子菌落提取其DNA，利用PCR扩增技术对提取的子囊孢子单菌落DNA进行交配型基因MAT1‑1‑1、MAT1‑1‑2和MAT1‑2‑1的检测；(6)配置营养液：由葡萄糖2%、蛋白胨0.5%、牛肉膏0.5%、七水硫酸镁0.1%、磷酸二氢钾0.1%、维生素b1 0.001%、维生素b12 0.001%、水96.798%组成，混合均匀即可；(7)将步骤（6）中营养液分装至三角瓶中，高温高压灭菌20～30分钟，取出冷却至常温备用；(8)选取步骤（5）检测的含有交配型基因MAT1‑1‑1和MAT1‑1‑2却不含有MAT1‑2‑1的单孢子形成的菌落，与含有交配型基因MAT1‑2‑1却不含有MAT1‑1‑1和MAT1‑1‑2的单孢子形成的菌落分别取2～5%大小的菌丝体块接种于步骤（7）制好的营养液中，置于震荡摇床中，设置19℃、避光、转速150rpm摇瓶培养4‑5天；(9)将步骤（8）培养好的菌丝体接种于人工培养基上，转移至温度17～25℃、湿度65～85%的环境下，暗培养5～7天，待培养基表面长出大量白色菌丝；(10)在步骤(9)的条件下，设置光照强度200～2000lux，进行见光转色，经过原基生成、出蕾生长、出草生长三个阶段，待虫草子实体长至4～5cm高度，再将子实体采收即可。