[发明专利]基于分子生物学技术的蛹虫草子囊孢子杂交育种方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于分子生物学技术的蛹虫草子囊孢子杂交育种方法。

背景技术

在真菌的有性生殖过程中，交配型能够说明真菌的遗传控制情况和有性生殖发展的过程，因此，交配型基因对真菌的性别控制和遗传进化起着决定性作用，也是性亲和表现型遗传决定因子。已知真菌的交配系统分为同宗配合和异宗配合两大类。同宗配合是一种自体可孕的有性生殖方式，异宗配合是一种自体不孕的有性生殖方式。异宗配合根据控制交配型的不亲和性因子是一对还是两对，分为两类：具有一对不亲和性因子的二极性异宗配合(bipolar heterot hallism)和具有两对不亲和性因子的四极性异宗配合(tetrapolar heterot hallism)。

蛹虫草是二极性异宗配合真菌。蛹虫草的两种不同的交配型是由单一的交配位点MAT1决定的。其中一个是MAT-alpha（MAT1-1），它含有一个编码α盒子蛋白的开放阅读框，此位点含有两个交配型基因：MAT1-1-1和MAT1-1-2。另一个是MAT-HMG(MAT1-2)，它含有一个编码一种调节蛋白的开放阅读框，而此调节蛋白含有HMG（High Mobility Group Proteins）蛋白上的DNA结合区域。MAT-HMG包含有一个交配型基因：MAT1-2-1。

异宗配合的真菌育种，主要手段是根据真菌有性生殖的特性，施行杂交育种。基本方法就是把基因型不同的两个双核菌株的单孢子分离出来，两两配对。如果这两个单孢子是属于不同的性别，即含有不同的不亲和性因子的话，配对后便是可亲和的。它们各自萌发成的单核菌丝便可交配形成具有结子实体能力的双核体。把许多不同的杂交双核体进行出草试验，根据出草试验结果便可筛选出想要的优质菌株。

聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。利用PCR扩增蛹虫草DNA后再通过电泳技术，可以达到对蛹虫草单孢子交配型基因检测的目的，再针对性地选择属于不同性别的单孢子进行两两配对，使杂交育种的效率大大提高。

当前，人工培植蛹虫草其获取菌种的方式主要采用的是无性繁殖技术，即直接从蛹虫草组织块上分离菌丝体的技术，其菌种遗传性状非常单一，不能多向选择更佳优良的菌种，虽然该技术能保持蛹虫草子实体的外观品相，但随着菌种的退化，其活性物质的含量下降非常明显，因此目前市场上大部分的蛹虫草子实体其活性物质极低，达不到作为药用的目的。

而通过分子生物学技术对蛹虫草子囊孢子交配型鉴定后，再将不同基因交配型的单孢子进行有性杂交，利用了生物基因重组与分离的特性，使得其菌种具有遗传多样性，可以筛选出蛹虫草子实体产量更高且能富集更多活性物质的菌种。

现报道公开了多种蛹虫草育种方式，而基于分子生物学技术辅助的蛹虫草子囊孢子杂交育种方式尚无报道。

发明内容

本发明涉及一种基于分子生物学技术的蛹虫草子囊孢子杂交育种方法，解决了蛹虫草菌种本身遗传特性导致子实体产量以及活性物质含量较低的问题。本方法周期较短，工作量较小，是一种高效的蛹虫草育种方法。

本发明主要是通过以下技术方案来实现的：

本发明所用到的蛹虫草菌种，来自于常德炎帝生物科技有限公司的菌种库，具体菌种为大孢子头品种、小孢子头品种、尖头孢子粉品种中的一种；本方法的具体步骤如下：

(1)在无菌条件下，将新鲜、成熟的蛹虫草子实体悬于水琼脂培养基上方，避免子实体与培养基接触；

(2)将其转移至生化培养箱中，21℃避光培养4-5天，使子囊孢子自然弹射到PDA培养基上；

(3) 在体式显微镜下挑取只有单个子囊孢子的菌落，再加入2ml的无菌水，搅拌均匀，制备成孢子悬液，取200微升的孢子悬浮液，涂布PDA平板培养基上，放置于21℃生化培养箱中避光培养；

(4)培养3-4天后，在超净工作台上选取肉眼可见的子囊孢子单菌落，转移至新的PDA平板培养基上，每个PDA平板培养基上只培养单个菌落；

(5) 培养5天后，取纯化的单个子囊孢子菌落提取其DNA，利用PCR扩增技术对提取的子囊孢子单菌落DNA进行交配型基因MAT1-1-1、MAT1-1-2和MAT1-2-1的检测；

(6) 配置营养液：由葡萄糖2%、蛋白胨0.5%、牛肉膏0.5%、七水硫酸镁0.1%、磷酸二氢钾0.1%、维生素b1 0.001%、维生素b12 0.001%、水96.798%组成，混合均匀即可；