[发明专利]一种去除单轴类兰花内生菌的方法及在香荚兰组织培养快速繁殖中的应用

摘要

本发明公开了一种去除单轴类兰花内生菌的方法及在香荚兰组织培养快速繁殖中的应用。本发明是使用利福平处理结合茎顶培养，去除单轴类兰花组织培养过程中外植体材料存在的内生菌，并将该方法与香荚兰组织培养快速繁殖相结合。本发明将特定浓度的、具有广谱杀菌能力的利福平添加至单轴类兰花培养基中，既可发挥其高效的杀菌、抑菌作用，继代4次即可彻底消除培养材料的内生菌，同时避免高浓度利福平对单轴类兰花的毒副作用；本发明还通过培养基中各种成分的合理搭配，促进单轴类兰花的大量繁殖。本发明成功解决香荚兰等单轴类兰花组培苗生产过程中内生菌难以去除的瓶颈问题，为其组织培养快速繁殖奠定基础，具有良好的应用价值。

主权项

1.一种去除单轴类兰花内生菌的方法，其特征在于，所述方法是使用利福平处理结合茎顶培养，去除单轴类兰花组织培养过程中外植体材料存在的内生菌；其中，所述利福平的配制方法是：用甲醇将医用的利福平粉剂配制成25～50mg/L浓度的利福平溶液装进已消毒灭菌的容器中，于4℃条件下保存待用；所述的茎顶培养包括：a、外植体的选择、处理和培养：选取健康香荚兰株系，以当年新萌生长的顶芽作为外植体，洗净后剪去叶片和气生根，在70％酒精中浸泡30s，用0.1％升汞溶液消毒5～10min，无菌水冲洗4～5次，切取高1～2cm带节的顶芽，接种于顶芽促长培养基中，然后将所述25～50mg/L浓度的利福平溶液3～5ml加至所述顶芽促长培养基中，在(25±2)℃、光照度1500～2000lx、光照12h/天条件下进行培养；b、切顶、继代培养：步骤a所述顶芽培养45天后，无菌条件下将所述顶芽的基部茎段切除，保留高1～2cm的顶芽插植到顶芽促长培养基中，将步骤a所述25～50mg/L浓度的利福平溶液3～5ml加至所述顶芽促长培养基中，在25±2℃、光照度1500～2000lx、光照12h/天条件下进行培养45天，然后重复继代培养2次，得到无菌的顶芽。