[发明专利]一种去除单轴类兰花内生菌的方法及在香荚兰组织培养快速繁殖中的应用

权利要求书

1.一种去除单轴类兰花内生菌的方法，其特征在于，所述方法是使用利福平处理结合茎顶培养，去除单轴类兰花组织培养过程中外植体材料存在的内生菌；

其中，所述利福平的配制方法是：用甲醇将医用的利福平粉剂配制成25～50mg/L浓度的利福平溶液装进已消毒灭菌的容器中，于4℃条件下保存待用；

所述的茎顶培养包括：

a、外植体的选择、处理和培养：选取健康香荚兰株系，以当年新萌生长的顶芽作为外植体，洗净后剪去叶片和气生根，在70％酒精中浸泡30s，用0.1％升汞溶液消毒5～10min，无菌水冲洗4～5次，切取高1～2cm带节的顶芽，接种于顶芽促长培养基中，然后将所述25～50mg/L浓度的利福平溶液3～5ml加至所述顶芽促长培养基中，在(25±2)℃、光照度1500～2000lx、光照12h/天条件下进行培养；

b、切顶、继代培养：步骤a所述顶芽培养45天后，无菌条件下将所述顶芽的基部茎段切除，保留高1～2cm的顶芽插植到顶芽促长培养基中，将步骤a所述25～50mg/L浓度的利福平溶液3～5ml加至所述顶芽促长培养基中，在25±2℃、光照度1500～2000lx、光照12h/天条件下进行培养45天，然后重复继代培养2次，得到无菌的顶芽。

2.一种香荚兰组织培养快速繁殖方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)无菌利福平溶液的配制：用甲醇将医用的利福平粉剂配制成25～50mg/L浓度的利福平溶液装进已消毒灭菌的容器中，于4℃条件下保存待用；

(2)外植体的选择、处理和培养：选取健康香荚兰株系，以当年新萌生长的顶芽作为外植体，洗净后剪去叶片和气生根，在70％酒精中浸泡30s，用0.1％升汞溶液消毒5～10min，无菌水冲洗4～5次，切取高1～2cm带节的顶芽，接种于顶芽促长培养基中，然后将步骤(1)所述25～50mg/L浓度的利福平溶液3～5ml加至所述顶芽促长培养基中，在(25±2)℃、光照度1500～2000lx、光照12h/天条件下进行培养；

(3)切顶、继代培养：步骤(2)所述顶芽培养45天后，无菌条件下将所述顶芽的基部茎段切除，保留高1～2cm的顶芽插植到顶芽促长培养基中，将步骤(1)所述25～50mg/L浓度的利福平溶液3～5ml加至所述顶芽促长培养基中，在(25±2)℃、光照度1500～2000lx、光照12h/天条件下进行培养45天，然后重复继代培养2次，得到无菌的顶芽；

(4)不定芽增殖培养：将步骤(3)所得无菌的顶芽转接至增殖培养基中，在(26±2)℃、光照度1500～2000lx、光照12h/天条件下进行培养，得到不定芽；

(5)不定根诱导及壮苗培养：把步骤(4)所得高3～4cm的不定芽插植至不定根诱导和壮苗培养基中，在(28±2)℃、光照度2000～3000lx、光照12h/天条件下进行培养60天，得到试管苗；

(6)移栽：将步骤(5)培养得到的试管苗在强光照下炼苗7天，取出试管苗，洗净附着的培养基，用千分之一的高锰酸钾溶液浸泡5min，以水苔为种植基质、于阴凉通风处对试管苗进行栽培；

其中，步骤(2)和步骤(3)中，所述顶芽促长培养基的pH为5.4～5.6，每升包括如下组分：花宝1号1～2g、花宝2号1～2g、七水硫酸亚铁20～40mg、乙二胺四乙酸二钠20～40mg、蛋白胨0.5～2g、椰子汁50～100mL、肌醇80～120mg、甘氨酸1.5～2.5mg、盐酸硫胺素0.05～0.2mg、盐酸吡哆醇0.4～0.8mg、烟酸0.4～0.8mg、6-苄基腺嘌呤0.1～0.5mg、萘乙酸0.1～0.5mg、蔗糖15～30g、琼脂6～7g；

步骤(4)中，所述增殖培养基的pH为5.4～5.6，每升包括如下组分：花宝1号1～2g、花宝2号1～2g、七水硫酸亚铁20～40mg、乙二胺四乙酸二钠20～40mg、蛋白胨0.5～2g、椰子汁100～150mL、肌醇80～120mg、甘氨酸1.5～2.5mg、盐酸硫胺素0.05～0.2mg、盐酸吡哆醇0.4～0.8mg、烟酸0.4～0.8mg、6-苄基腺嘌呤3.0～5.0mg、萘乙酸0.1～0.5mg、蔗糖15～30g、琼脂6～7g；

步骤(5)中，所述不定根诱导和壮苗培养基的pH为5.4～5.6，每升包括如下组分：花宝1号1～2g、蛋白胨0.5～2g、土豆泥40～80g、肌醇80～120mg、甘氨酸1.5～2.5mg、盐酸硫胺素0.05～0.2mg、盐酸吡哆醇0.4～0.8mg、烟酸0.4～0.8mg、萘乙酸0.2～0.5mg、蔗糖15～30g、琼脂6～7g。