[发明专利]一种提高玉米秸秆水解液培养油脂酵母产油量的方法

摘要

一种提高玉米秸秆水解液培养油脂酵母产油量的方法，属于微生物应用技术领域。本发明的目的是将细菌纤维素固定化后的油脂酵母投入到玉米秸秆水解液中，水解液对油脂酵母的毒性和抑制性减弱，提高油脂酵母微生物油脂产量的提高玉米秸秆水解液培养油脂酵母产油量的方法。本发明步骤是：细菌纤维素的制备、细菌纤维素固定化弯曲隐球酵母的制备、玉米秸秆水解液的制备、细菌纤维素固定化弯曲隐球酵母在玉米秸秆水解液中的培养。本发明为玉米秸秆的稳定利用提供了技术支持，可以达到经济效益和环境效益的双赢。

主权项

一种提高玉米秸秆水解液培养油脂酵母产油量的方法，其特征在于：其步骤是：（1）细菌纤维素的制备：Ａ．木醋杆菌冻干菌体的恢复培养：在无菌条件下，用浸在体积分数为90%（v/v）酒精中的脱脂棉擦净安瓿瓶，用酒精灯外焰将安瓿瓶顶端加热，然后滴无菌水至加热的安瓿瓶顶端，使安瓿瓶瓶口玻璃开裂，用镊子敲下已开裂的安瓿瓶的顶端；向保存在安瓿瓶内编号为CGMCC NO：1.1812的木醋杆菌Gluconacetobacterxylinum的冻干菌体，滴入0.6mL的木醋杆菌富集培养基，轻轻振荡，得到木醋杆菌冻干菌体悬浮液；上述所述的木醋杆菌富集培养基成分重量份组成分别为：葡萄糖60.0，蛋白胨15.0，柠檬酸1.0，Na2HPO4·12H2O 0.8，KH2PO4 2.5，MgSO4·7H2O 0.5，去离子水1L，pH 7.0；吸取100uL上述木醋杆菌冻干菌体悬浮液，用涂布棒均匀涂布于木醋杆菌固体培养基上，所述的木醋杆菌固体培养基重量份组成成分分别为：葡萄糖60.0，蛋白胨15.0，柠檬酸1.0，Na2HPO4·12H2O 0.8，KH2PO4 2.5，MgSO4·7H2O 0.5，琼脂20.0，去离子水1L，pH 7.0；将上述涂有木醋杆菌的固体培养基在28℃恒温电热培养箱中培养48h，得到恢复培养好的木醋杆菌，保存于4℃的冰箱中，备用；B．木醋杆菌种子液的制备：将上述步骤A得到的恢复培养好的木醋杆菌，用接种环挑取一环菌种，转接到装有100mL木醋杆菌种子培养基的500mL锥形瓶中，上述木醋杆菌种子培养基重量份组成成分分别为：葡萄糖30.0，蛋白胨5.0，柠檬酸3.0，Na2HPO4·12H2O3.0，MgSO4·7H2O0.20，去离子水1L，pH 7.0；在28℃，180r/min的恒温振荡器中振荡36h，得到木醋杆菌种子液；C．细菌纤维素的制备：将上述步骤B得到的木醋杆菌种子液以体积比10%（v/v）的接种量，接入到装有100mL木醋杆菌发酵培养基的方形容器中，方形容器的尺寸为：底面边长8cm×8cm，高度为8cm，上述所述木醋杆菌发酵培养基重量份组成成分分别为：葡萄糖100.0，蛋白胨20.0，柠檬酸3.0，Na2HPO4·12H2O 2.5，KH2PO4 3.5，MgSO4·7H2O 0.5，去离子水1L，pH 7.0；然后将方形容器静置于28℃恒温电热培养箱中培养6天，在木醋杆菌发酵培养基表面得到细菌纤维素；D．细菌纤维素的提取和处理：用镊子将上述步骤C得到的细菌纤维素取出，并用去离子水冲洗3次后，浸入100mL浓度为0.05mol/L的NaOH溶液中，60℃水浴120min，除去细菌纤维素表面残存的菌体和培养基，然后用去离子水反复冲洗至中性，将细菌纤维素裁剪成4cm×4cm的小块，在灭菌锅中于121℃条件下灭菌15min后，放入4℃冰箱保存，备用；（2）细菌纤维素固定化弯曲隐球酵母的制备A．弯曲隐球酵母种子液的制备：将保存在斜面上的菌株编号为ATCC 20509的弯曲隐球酵母Cryptococcus curvatus接入种子培养基中，上述所述的种子培养基各组分占种子培养基质量用量百分比分别为：葡萄糖3%，酵母浸粉1.5%，蛋白胨1.5%；在28℃，160r/min的恒温振荡摇床中振荡培养20h，得到弯曲隐球酵母种子液；B．细菌纤维素固定化弯曲隐球酵母：用注射器吸取1mL~2 mL上述步骤（2）中步骤A得到的弯曲隐球酵母种子液，均匀注射到上述步骤（1）中步骤D得到的尺寸为4cm×4cm的小块细菌纤维素中，用去离子水清洗注射弯曲隐球酵母种子液的细菌纤维素3次，得到细菌纤维素固定化的弯曲隐球酵母；（3）玉米秸秆水解液的制备 A．玉米秸秆粉的制备：玉米秸秆经去离子水清洗干净后放入80℃恒温干燥箱中烘干至恒重，切成3cm小段后用粉碎机粉碎至粉状，玉米秸秆粉状颗粒直径为0.3 mm；Ｂ．玉米秸秆水解液的制备：称取30g上述步骤（3）中步骤A得到的玉米秸秆粉，将其置于1L三角瓶中，按固液比为1:10（w/v）加入300mL 体积分数为2.0%（v/v）的稀硫酸，充分混合均匀后，用封口膜将三角瓶口盖好，在灭菌锅中于121℃下水解60min；将得到的水解液冷却至室温后，先用四层纱布真空抽滤，弃纱布上的玉米秸秆残渣，取所得粗抽滤液；将所得的粗抽滤液再用滤纸进行真空抽滤，弃滤纸上的玉米秸秆残渣，取所得到的细抽滤液；将细抽滤液用质量分数为10%（w/v）的Ca(OH)2调节pH值至10，静止1h后，再用滤纸进行真空抽滤，弃滤纸上的残渣，取所得到的精细抽滤液；将精细抽滤液用2mol/L硫酸调节pH值至6，用滤纸抽滤，得到最终抽滤液；将最终抽滤液在灭菌锅中于121℃条件下灭菌15min，得到玉米秸秆水解液，放入4℃冰箱保存，备用；（4）细菌纤维素固定化弯曲隐球酵母在玉米秸秆水解液中的培养A．纤维素酶溶液的制备：将7.5g纤维素酶R‑10溶于500mL浓度为0.05mol/L，pH值为5.0的磷酸氢二钠‑柠檬酸溶液中，得到质量分数为1.5%（w/v）的纤维素酶溶液，放入4℃冰箱，备用；B．细菌纤维素固定化的弯曲隐球酵母在玉米秸秆水解液中的培养：将120g~150g上述步骤（2）中步骤B得到的细菌纤维素固定化弯曲隐球酵母接入500mL上述步骤（3）中步骤B得到的玉米秸秆水解液中，每隔24h监测水解液中还原糖的变化，当水解液中还原糖全部耗尽时，完成细菌纤维素固定化弯曲隐球酵母在玉米秸秆水解液中的培养。