[发明专利]一种亚硝酸降解分析低分子肝素二糖结构的方法

摘要

本发明涉及一种亚硝酸降解分析低分子肝素二糖结构的方法，本发明将低分子肝素经亚硝酸降解后，进行多孔石墨化碳色谱与高分辨率质谱联用分析肝素二糖组成单元中糖醛酸的同分异构体。通过亚硝酸将低分子肝素降解成二糖单元，并通过多孔石墨化碳色谱法分离各同分异构体，再通过高分辨率质谱获取精确分子量，从而对低分子肝素完全降解的二糖单元进行分析。

主权项

一种亚硝酸降解分析低分子肝素二糖结构的方法，其特征在于，包括步骤如下：(1)配制肼解溶液：配制硫酸肼浓度为0.5‑2％(w/w)、肼浓度为40‑80％(v/v)的肼解溶液；(2)称量一定量的低分子肝素样品，将其溶解在步骤(1)配制的肼解溶液中，低分子肝素的浓度为0.5～1mg/mL；在90‑98℃下加热3‑5h后，停止加热并冷却到0℃以下；在20‑40℃下反复蒸发，直至彻底除去残留肼，获取转干的肼解过的低分子肝素样品；(3)配制pH值为1.5‑2的HNO2试剂；(4)将步骤(2)获取的低分子肝素样品溶解于步骤(3)获取的HNO2试剂中，低分子肝素样品的浓度为0.5～1mg/mL，冰浴振荡15～20min后，将pH值调至3.5‑4.5；(5)配制pH值为3.5‑4.5的HNO2试剂；(6)加入与步骤(4)最终获取的溶液等体积的步骤(5)配制的HNO2试剂于步骤(4)最终获取的溶液中，冰浴振荡30～40min后，将pH值调至8‑10；(7)加入与步骤(2)中称量的低分子肝素样品1‑2倍质量的硼氢化物溶液于步骤(6)最终获取的溶液中；25‑50℃下还原8～12h；(8)将步骤(7)最终获取的溶液的pH值调至3‑5后，反应15～20min后，再将溶液的pH调至中性，获得HNO2降解后的低分子肝素样品；(9)采用G‑10色谱法进行一次脱盐，一次脱盐完成后进入步骤(10)或步骤(11)；(10)通过GPC色谱法进行二次脱盐，二次脱盐完成后进入步骤(12)；(11)PGC色谱与质谱联用分析：将步骤(9)脱盐后的经过HNO2降解的低分子肝素样品溶于去离子水，配制成浓度为0.5～2mg/mL的待测溶液；配制流动相A：配制0.1‑0.2％的甲酸，并用氨水调pH至5‑6；配制流动相B：配制0.1‑0.2％的甲酸，80‑90％的乙腈，用氨水调pH至5‑6；用多孔石墨化碳色谱柱分离，流速为100‑200μL/min，洗脱梯度如下，均为体积百分比：0～30min，100％流动相A；30‑34min，83‑87％流动相A，13‑17％流动相B；34～90min，83‑87％流动相A，13‑17％流动相B；90～100min，100％流动相B；100～115min，100％流动相A；进入步骤(13)；(12)PGC色谱与质谱联用分析：将步骤(10)脱盐后的经过HNO2降解的低分子肝素样品溶于去离子水，配制成浓度为0.5～2mg/mL的待测溶液；配制流动相A：配制0.1‑0.2％的甲酸，并用氨水调pH至5‑6；配制流动相B：配制0.1‑0.2％的甲酸，80‑90％的乙腈，用氨水调pH至5‑6；用多孔石墨化碳色谱柱分离，流速为100‑200μL/min，洗脱梯度如下，均为体积百分比：0～4min，83‑87％流动相A，13‑17％流动相B；4～60min，83‑87％流动相A，13‑17％流动相B；60～70min，100％流动相B；70～85min，100％流动相A；进入步骤(13)；(13)在负离子模式下用高分辨质谱仪进行检测，得到高分辨质谱图；(14)根据步骤(13)中获得的高分辨质谱图，并按照不同结构形式的质荷比，得到提取离子流图；(15)通过质荷比的数值确定组分分子式，解析该组分的质谱MS/MS信息对不同组分的硫酸基团进行位置归属，确定各峰结构。