[发明专利]一种虾蟹类富水性组织的石蜡切片制作方法

摘要

本发明涉及一种虾蟹类富水性组织的石蜡切片制作方法；常规的石蜡组织切片方法指标对于组织形态难固定、质地柔软、富水性的虾蟹类组织器官缺乏组织区分度，易造成组织破碎、重叠、折曲，严重影响组织的显微观察效果，难以获得理想清晰的组织结构。本发明通过对样品的负压、固定和包埋处理进而定型组织、延展组织避免褶皱重叠和因富水性组织的弹性而存在误差。本发明操作简便、可行性强、周期短，对于组织形态难固定、质地柔软、富水性的虾蟹类组织器官具有很好的组织区分度，可以实现完整的组织形态的石蜡切片观察，能满足研究人员对切片组织观察的全部要求。

主权项

1.一种虾蟹类组织的石蜡切片方法，其特征在于步骤如下：1）将样品组织放于组织固定液中，立即负压固定，负压至样品组织块膨胀饱满、不再产生气泡；再立即加入到盛有相同浓度的组织固定液的适宜体积的离心管中，离心管中组织固定液的量与样品组织体积之比为20：1；避免组织块贴于容器壁上，室温恒温固定4‑6h；所述负压的压力值为‑1.25kpa；负压容器总容积：容器中组织固定液总体积:样品组织体积=6:3:1；所述组织固定液为溶质质量分数2.5%的多聚甲醛溶液；多聚甲醛溶液具体制备方法为：取多聚甲醛50g，1×PBS缓冲溶液900ml，加水至1000ml，混合后60℃下水浴24h，若还有未溶解的多聚甲醛，滴加1‑2滴1当量（1mol/L）的NaOH溶液，调节PH为6.8‑7.2，4℃下保存；0.01M所述1×PBS缓冲溶液的组份为：Na₂HPO₄ 8mM，NaCl 136mM，KH₂PO₄ 2mM，KCl 2.6mM，PH=7.2‑7.4；所述1当量的NaOH溶液为：称取NaOH固体粉末10g，用250mL的容量瓶配置成250mL 、1mol/L的NaOH溶液；2） 将步骤1）固定后的样品组织放入包埋盒中，用流动清水不间断流动冲洗包埋盒24h；洗除样品组织中残留的固定液；3）对冲洗完毕的样品组织在常温下，依次用梯度浓度为30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液脱水处理；浓度为30%的乙醇溶液脱水处理时间分别为4h‑5h；浓度为40%、50%、60%、70%的乙醇溶液脱水处理时间分别为40min‑1h，浓度为80%、90%、100%的乙醇脱水处理时间分别为15min‑35min；当乙醇溶液浓度≤70%时，所述乙醇溶液与样品组织的体积比为50:1；当乙醇溶液浓度浓度≥70%时，所述乙醇溶液与样品组织的体积比为35:1；脱水处理完成后将装有样品组织的包埋盒从无水乙醇溶液中取出；所述组织脱水步骤为：a）25℃，30％浓度的乙醇中持续处理4h；b）25℃，40％浓度的乙醇中持续处理40min；c）25℃，50%浓度的乙醇中持续处理40min；d）25℃，60%浓度的乙醇中持续处理40min；e）25℃，70％浓度的乙醇中持续处理40min；f）25℃，80％浓度的乙醇中持续处理40min；g）25℃，90％浓度的乙醇中持续处理40min；h）25℃，95％浓度的乙醇中持续处理40min；i）25℃，100％浓度的乙醇中持续处理(Ⅰ)15min；j）25℃，100％浓度的乙醇中持续处理(Ⅱ)15min； 4） 将步骤3）中取出的包埋盒放入透明剂中进行透明处理；所述透明剂为溶质质量分数为50%的二甲苯Ⅰ溶液、溶质质量分数为95%的二甲苯Ⅱ溶液；透明处理步骤如下：a）甩净残余包埋盒无水乙醇溶液，以悬空重力作用30s后无乙醇溶液液滴滴下为标准；b）将包埋盒先放入二甲苯Ⅰ溶液中40min后再放入二甲苯Ⅱ溶液中30min；5）把透明好的样品组织放入蜡槽，60℃下渗蜡1h；渗蜡完成后运用金属包埋器进行包埋，待完全冷却凝固后将包埋器去掉；6）扭紧固定好切片机机头，稳固刀架结构，调整切片厚度为5μm；首先进行切片的预实验修整，直至切出完整的最大组织切面后，再进行正式切制；将切片平整铺开，轻拖使其单层铺于展片机的恒温水体表层；自然晾干12h，100℃烤箱中烘烤2h；所述预实验修整分三步进行：一是切平面，每一刀切出的切片都是5μm均匀厚度的单片组织切片，避免出现厚度不均；二是切大小，每一刀切出的切片的横截面形状和面积相似；三是切微观组织，通过将切片不断在显微镜下进行观察，保证切出的切片微观组织既要满足横切、纵切的要求，同时清晰可见；7）将烘干后的切片用二甲苯溶液进行脱蜡处理，脱蜡完成后用100%、95%、90%、80%、70%、60%的浓度梯度乙醇溶液和伊红‑苏木精染液进行染色处理；最后，用中性树胶将染色完成的切片进行封片处理，并用恒温箱将封好的切片作干燥处理；所述脱蜡步骤为：取已经干燥的切片，放于盛有溶质质量分数为95%的二甲苯Ⅱ溶液中脱蜡10min；染色处理步骤如下：a）25℃，100％乙醇溶液持续处理10min；b）25℃，95％乙醇溶液持续处理10min；c）25℃，90％乙醇溶液持续处理10min；d）25℃，80％乙醇溶液持续处理10min；e）25℃，70％乙醇溶液持续处理10min；f）25℃，60％乙醇溶液持续处理10min；g）25℃，蒸馏水持续处理5min，4℃冷却3min；h）25℃，苏木紫染液持续处理10min，4℃冷却3min；i）25℃，蒸馏水轻沾1‑2次，4℃冷却1‑2min；j）25℃，分色液持续处理5s，4℃冷却10s；11）25℃，去离子水轻沾1‑2次，4℃冷却3min；所述分色液组分为：溶质质量分数70％的酒精100ml和盐酸 1ml；k）25℃，伊红染液持续处理1min，4℃冷却10s；l）25℃，90%乙醇溶液持续处理2min；m）25℃，95%乙醇溶液持续处理2min；n）25℃，100%乙醇溶液持续处理10min；o）25℃，溶质质量分数为50%的二甲苯Ⅰ溶液持续处理10min；p）25℃，溶质质量分数为50%的二甲苯Ⅱ溶液持续处理10min。