[发明专利]一种针对乳腺癌的Car‑NK细胞制备方法

摘要

本发明公开了一种针对乳腺癌的Car‑NK细胞制备方法，该方法包括如下步骤采集患者外周富集血，滤除白细胞后缓慢移入装有淋巴细胞分离液的离心管中，用密度梯度离心法离心，吸取白膜层，得到外周血单个核细胞；取重悬液90mL加入已灭活的自体血清10mL和IL‑2 10ng/mL,接种至六孔培养板中，六孔培养板中加入有0.9％氯化钠注射液和Lymactin‑NK；培养36‑48h后于培养板中加入终浓度为IL‑2、IL‑15和IL‑21；将慢病毒对NK细胞进行转染并扩增培养，获得CAR‑NK细胞。本发明公开了一种Car‑NK细胞的制备方法，通过Ficoll法从乳腺癌患者外周血中分离核细胞，并通过IL‑2+IL‑15+IL‑21组合培养方案体外扩增NK细胞，所述制备方法方便易操作，得到的Car‑NK细胞可以通过制备细胞制剂的方法注射进入患者体内，对乳腺癌的治疗起到极大的帮助。

主权项

一种针对乳腺癌的Car‑NK细胞制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：S1、采集患者外周富集血，滤除白细胞后缓慢移入装有淋巴细胞分离液的离心管中，用密度梯度离心法离心，吸取白膜层，得到外周血单个核细胞；S2、将S1中得到的外周血单个核细胞用PBS洗涤，弃去上清液，取细胞沉淀中加入GT551重悬，调整细胞浓度为2‑2.5x106；S3、取S2中的重悬液90mL加入已灭活的自体血清10mL和IL‑210ng/mL,接种至六孔培养板中，六孔培养板中加入有0.9％氯化钠注射液和Lymactin‑NK；S4、培养36‑48h后于培养板中加入终浓度为800‑1200IU/ml IL‑2、100‑200IU/ml IL‑15和10‑20IU/ml IL‑21，培养6‑8d后补加灭活自体血浆、IL‑2、IL‑15和IL‑21，继续培养2‑3d得到NK细胞；S5、将慢病毒对S4中的NK细胞进行转染并扩增培养，获得CAR‑NK细胞。