[发明专利]一种无血清悬浮培养伪狂犬病毒的方法

摘要

本发明提供了一种无血清悬浮培养伪狂犬病毒的方法，包括以下步骤将种子细胞在血清含量为8％的培养基中培养3代，再于血清含量为5％的培养基培养3代，最后用血清含量为2％的培养基培养3代，然后按血清含量为1％、0.5％、0.2％、0的降低方式培养种子细胞至每个阶段连续3天细胞活力均高于90％后，置于生物反应器中扩大培养，将增殖后的伪狂犬病毒按MOI＝1接入所得扩大培养后的种子细胞中再次进行扩大培养，制得病毒液。该制备工艺稳定，重复性好，病毒滴度高，能有效降低生产成本，易规模化放大培养，可显著提高产品质量，提高批次间同一性。

主权项

一种无血清悬浮培养伪狂犬病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)种子细胞活化将液氮冻存的种子细胞先用血清含量为8％的培养基培养3代后，然后用血清含量为5％的培养基培养3代，再用血清含量为2％的培养基培养3代；(2)种子细胞的无血清驯化将培养基中血清含量从2％降低至1％，培养至连续3天种子细胞活力均高于90％，将血清含量降低至0.5％，培养至连续3天种子细胞活力均高于90％，将血清含量降低至0.2％，培养至连续3天种子细胞活力均高于90％，将血清含量降低至0，传代培养，每代培养72h，培养至连续3天种子细胞活力均高于90％，停止驯化；(3)在生物反应器中培养将驯化后的种子细胞置于生物反应器中培养，培养3‑6天；(4)伪狂犬病毒的增殖将伪狂犬病毒接种于生长良好的ST单层种子细胞进行培养，培养温度为37℃，培养时间为24‑48h，待病变达到80％以上时，收获伪狂犬病毒液；(5)接种病毒当生物反应器中种子细胞密度达到7.0×106cell/ml以上时，按MOI＝0.5‑2接种步骤(4)获得的伪狂犬病毒液；(6)病毒规模化培养将步骤(5)所得混合物置于生物反应器中培养，培养至细胞病变≥60％且溶氧曲线保持稳定状态时，收获病毒液，于‑80℃保存。