[发明专利]一种基于免疫痕迹法鉴别古代丝织品残片蚕丝种类的方法

摘要

本发明涉及文物检测领域，公开了一种基于免疫痕迹法鉴别古代丝织品残片蚕丝种类的方法，先以红薯为碳源制备了荧光碳点，然后用荧光碳点标记桑蚕丝和柞蚕丝蚕丝的二抗，之后逐步采用离子液体和PM₁₃‑碱性蛋白酶对混淆的古代丝织品文物样进行水解，得到蛋白提取液后，经透析、纯化，进行SDS‑PAGE凝胶电泳，将得到的蛋白条带转移到PVDF膜上，经蚕丝一抗和荧光碳点标记的二抗孵育后，可在凝胶成像系统中观察到免疫荧光条带，鉴别古代丝织品的种类。本发明中化学试剂用量少，反应温和、环保无害；在对古代丝织品进行检测时，具有样品用量少、直观、快速和高灵敏性的特点。

主权项

1.一种基于免疫痕迹法鉴别古代丝织品残片蚕丝种类的方法，其特征在于采用如下步骤：1)荧光碳点的制备：将红薯碎块和KH2PO4浸入蒸馏水中，于水热反应釜内反应，取出反应液，经超声、抽滤、透析得到荧光碳点溶液，之后经冷冻干燥，得到荧光碳点粉末；2)荧光碳点标记蚕丝丝素蛋白二抗的制备：将荧光碳点分散在PBS缓冲液中，加入碳化二亚胺后，分别加入桑蚕丝和柞蚕丝丝素蛋白二抗，制得荧光碳点标记桑蚕丝二抗和荧光碳点标记柞蚕丝二抗；3)分别称取等质量已被混淆的由桑蚕丝、柞蚕丝和蓖麻蚕丝制作的古代纺织品残片作为样品，小心用去离子水清洗，去除表面污染物，烘干，分别标记为A，B，C三组；4)将A，B，C三组样品以1∶95‑105的浴比在含有0.4‑0.6wt％Na2HPO4和0.2‑1.2wt％C17H35COONa的混合溶液中煮沸25‑35min，进行脱胶处理，共脱胶两次；脱胶之后，样品用去离子水小心搓洗4次以上，放入烘箱干燥；5)将A，B，C三组古代丝织品残片以1∶45‑55的浴比浸入[AMIM]Cl离子液体中，加热反应，冷却；加入PM13‑碱性蛋白酶粉末恒温孵育5‑7h，进行灭酶，得到三组丝素蛋白/离子液体溶液A、B、C；6)待丝素蛋白/离子液体溶液冷却至室温，加入无水乙醇，反复浸泡，使丝素蛋白析出，对混合物进行真空抽滤，向滤出的丝素蛋白中加入去离子水，反复浸泡后过滤，分别得到丝素蛋白提取液A、B、C；将三组丝素蛋白提取液在1‑5℃条件下用透析袋透析10‑14h，除去小分子杂质；对透析后的丝素蛋白提取液进行真空浓缩，在2500‑3500rpm、温度8‑12℃条件下浓缩至终体积约为200μL，得到丝素蛋白浓缩液A、B、C；7)SDS‑PAGE凝胶电泳：分别量取45‑55μL丝素蛋白浓缩液A、B、C，用CB 9.6缓冲液稀释至4.5‑5.5mL，在98‑102℃条件下加热4‑6min，进行变性处理；冷却后至室温后，将三种样品和蛋白质Marker加入制备好的免染胶加样孔中，在电解槽中加满电解液，电泳完成后，在成像系统中观察电泳图像；本实验中一次制作两张样品胶，记为胶1、胶2；8)电转移：将电泳后的胶平铺在经甲醇和电转缓冲液处理过的PVDF膜上，夹在滤纸和海绵中间组装成转运夹层，放入湿式转膜装置中，恒流转膜；可得到两张电转移膜，记为膜1、膜2；9)膜成像：电转移完成后，取出PVDF膜，放入凝胶成像系统中成像，观察蛋白条带转移情况；10)封闭：取出PVDF膜，用14‑16mL的TBS液洗膜4‑6min，用封闭液在室温条件下处理50‑70min；11)免疫处理：用抗体稀释液以950‑1050∶1的体积比稀释桑蚕丝一抗，将膜1浸没在一抗稀释液中，室温条件下摇床孵育1～2h；取出膜1后用TBST液洗膜，之后浸入8‑12mL稀释的荧光碳点标记的桑蚕丝二抗液中室温条件下孵育1‑25h；膜2用柞蚕丝抗体进行同样处理；12)发光显色：直接将免疫处理后的膜1、膜2在凝胶成像系统中成像，利用荧光碳点在紫外光照射下发射荧光的性能，得到免疫印迹图像；膜1中得到荧光条带为桑蚕丝纺织品残片，膜2中得到荧光条带的为柞蚕丝纺织品残片，则另一样品即为蓖麻蚕丝纺织品残片。