[发明专利]一种用膜荚黄芪种子提取膜荚黄芪凝集素蛋白的方法及应用

摘要

本发明属生物技术领域，提供一种用膜荚黄芪种子提取膜荚黄芪凝集素蛋白的方法，该膜荚黄芪凝集素蛋白在抗菌、抗肿瘤方面的应用。以膜荚黄芪种子为原料，经脱壳粉碎、提取、分离、纯化得到膜荚黄芪凝集素蛋白，得到的膜荚黄芪凝集素AML分子量为70kD；含糖量为14.8%，含有15种氨基酸，其中带电荷与极性氨基酸为70%，疏水性氨基酸为30%。另外，与提高免疫相关的氨基酸Asp/Asn和Arg含量较高，接近30%。AML具有较好的人类O型血和兔血凝集偏好，同时其凝集活性具有较好的温度稳定性、PH稳定性和金属离子稳定性。AML有利于功能食品、医药和其它领域的开发利用。

主权项

一种用膜荚黄芪种子提取膜荚黄芪凝集素蛋白的方法，以膜荚黄芪种子为原料，经脱壳粉碎、提取、分离、纯化得到膜荚黄芪凝集素蛋白，其特征在于：具体步骤如下：（1）膜荚黄芪种子处理：洗净的膜荚黄芪种子105℃烘干4.5‑5.5h，脱壳粉碎后获得100目干粉，准确称取50g粉末，加入pH5.0 的醋酸盐缓冲液500 ml，置于4 ℃冰箱中抽提24 h，纱布过滤，12000 r/min 离心20 min，收集上清液，磁力搅拌器上加入硫酸铵，使之饱和度达到80%，4℃搅拌过夜，12000 r/min 离心20 min，弃上清，将沉淀加入20 mmol/l、pH7.0 的Tris‑HCl 缓冲液30 ml进行溶解，置于透析袋中，用同样的缓冲液透析，除去硫酸铵，24 h后冷冻干燥，于‑20 ℃的冰箱中保存备用；（2）将步骤（1）制备的蛋白粗品200 mg溶于20 mmol/L、pH7.0 的Tris‑HCl 缓冲液2 ml，用HiTrap SP XL柱离子交换层析，在AKTATM Explore 进行初步分离，收集洗脱峰；（3）纯化：将步骤（2）得到的蛋白样品，进行凝胶色谱SUPERDEX G25分离纯化，再用10 mmol /l 、pH7.0 Tris‑HCl 缓冲液洗脱，调节流速在0.5 ml/min，收集各个洗脱峰；经SUPERDEX‑G25分子筛层析后，得到一个主要的蛋白峰，进行常规凝血实验鉴定具有凝血活性，即为膜荚黄芪凝集素蛋白AML，对其冻干保存备用；（4）检测：步骤（3）获得的膜荚黄芪凝集素蛋白AML进行12.5%，SDS‑PAGE检测，为单一条带，分子量为70kD；所得膜荚黄芪凝集素蛋白AML含糖量为14.8%，含有15种氨基酸，其中带电荷与极性氨基酸为70%，疏水性氨基酸为30%。