[发明专利]一种用膜荚黄芪种子提取膜荚黄芪凝集素蛋白的方法及应用

说明书

本发明属生物技术领域，提供一种用膜荚黄芪种子提取膜荚黄芪凝集素蛋白的方法，该膜荚黄芪凝集素蛋白在抗菌、抗肿瘤方面的应用。以膜荚黄芪种子为原料，经脱壳粉碎、提取、分离、纯化得到膜荚黄芪凝集素蛋白，得到的膜荚黄芪凝集素AML分子量为70kD；含糖量为14.8%，含有15种氨基酸，其中带电荷与极性氨基酸为70%，疏水性氨基酸为30%。另外，与提高免疫相关的氨基酸Asp/Asn和Arg含量较高，接近30%。AML具有较好的人类O型血和兔血凝集偏好，同时其凝集活性具有较好的温度稳定性、PH稳定性和金属离子稳定性。AML有利于功能食品、医药和其它领域的开发利用。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用膜荚黄芪种子提取膜荚黄芪凝集素蛋白的方法及应用。

背景技术

膜荚黄芪（Astragalus membranaceus），中国的传统中药黄芪已有2000多年的用药史，其广泛的药用价值及多种功效已被历史所证实。黄芪单独、组合用药或者作为补充食品，有促进人体健康和免疫平衡的作用。现代药理研究证实中药黄芪具有调节机体免疫力、抗氧化、促进造血、调节机体代谢等作用，通过抗脂质过氧化，加强对氧自由基的清除，对缺氧复氧内皮细胞产生保护作用。近期的研究表明黄芪通过激活小鼠B细胞和巨噬细胞来调节机体免疫，恢复性抑制有丝分裂，抑制荷瘤小鼠白血病和淋巴瘤肿瘤细胞生长。黄芪的免疫调节活性，可能与一些功能性蛋白质、多糖或类黄酮有关。然而，对黄芪蛋白类提取物免疫调节作用的报道尚未多见，其机制未被阐明。因此分离黄芪功能性蛋白质，研究其对免疫调节相关细胞因子的作用，是黄芪免疫调节作用研究中非常有意义的一个方向。

凝集素（Lectin），凝集素具有多种生物学功能，其潜在的研究价值逐渐被挖掘。凝集素是一类非免疫性的蛋白或糖蛋白，能可逆地、特异地与碳水化合物相互作用，具有多变的氨基酸序列，广泛的分布于微生物、病毒及植物中。凝集素有多种功能、结构、组织定位及糖结合特异性。近年来的研究表明，植物凝集素具有多种多样的生物活性：（1）杀虫作用；（2）抗真菌作用；（3）抗肿瘤作用；（4）抗病毒作用。研究发现植物凝集素可应用于机体防御、体外给药，以及多种疾病的治疗。

发明内容

本发明的目的是提供一种用膜荚黄芪种子提取膜荚黄芪凝集素蛋白的方法，另一目的是提供了该膜荚黄芪凝集素蛋白在抗菌、抗肿瘤方面的应用。

本发明由如下技术方案实现的：一种用膜荚黄芪种子提取膜荚黄芪凝集素蛋白的方法，以膜荚黄芪种子为原料，经脱壳粉碎、提取、分离、纯化得到膜荚黄芪凝集素蛋白，具体步骤如下：

（1）膜荚黄芪种子处理：洗净的膜荚黄芪种子105℃烘干4.5-5.5h，脱壳粉碎后获得100目干粉，准确称取50g粉末，加入pH5.0 的醋酸盐缓冲液500 ml，置于4 ℃冰箱中抽提24 h，纱布过滤，12000 r/min 离心20 min，收集上清液，磁力搅拌器上加入硫酸铵，使之饱和度达到80%，4℃搅拌过夜，12000 r/min 离心20 min，弃上清，将沉淀加入20 mmol/l、pH7.0 的Tris-HCl 缓冲液30 ml进行溶解，置于透析袋中，用同样的缓冲液透析，除去硫酸铵，24 h后冷冻干燥，于-20 ℃的冰箱中保存备用；

（2）初分离：将步骤（1）制备的蛋白粗品200 mg溶于20 mmol/L、pH7.0 的Tris-HCl缓冲液2 ml，用HiTrap SP XL柱离子交换层析，在AKTATM Explore 进行初步分离，收集洗脱峰；

（3）纯化：将步骤（2）得到的蛋白样品，进行凝胶色谱SUPERDEX G25分离纯化，再用10mmol/l 、pH7.0 Tris-HCl缓冲液洗脱，调节流速在0.5 ml/min，收集各个洗脱峰；经SUPERDEX-G25分子筛层析后，得到一个主要的蛋白峰，进行常规凝血实验鉴定具有凝血活性，即为膜荚黄芪凝集素蛋白AML，对其冻干保存备用；