[发明专利]一种快速评估睾丸生精功能的免疫荧光染色法及其试剂盒

摘要

本发明提供了一种用于快速评估睾丸生精功能情况的抗体组合、方法及检测试剂盒，所述抗体组合包括：(1)由FITC荧光标记的兔抗人源GFRA1抗体及PE荧光标记的鼠抗人源c‑KIT抗体；(2)由FITC荧光标记的兔抗人源SCP3抗体及PE荧光标记的鼠抗人源PNA抗体。以睾丸生精小管作为检测样品，通过免疫组织化学荧光染色检测样品GFRA1、c‑KIT、SCP3和PNA表达情况判断各级生精细胞是否存在，从而评估患者的生精功能。本发明首次在术中/术后将生殖细胞表面标志物的免疫荧光化学染色用于快速评价患者的生精功能，检测速度快，具有极高的敏感度和可靠的特异度，并且能将各阶段的生精细胞区分开来，对于患者的评估和后续治疗有着重要的价值。

主权项

1.一种用于快速评估睾丸组织生精功能的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括荧光标记的染料试剂D1、试剂D2，所述试剂D1由荧光标记的兔抗人源GFRA1抗体及荧光标记的鼠抗人源c‑KIT抗体组成；所述试剂D2由荧光标记的兔抗人源SCP3抗体及荧光标记的鼠抗人源PNA抗体组成；所述试剂盒还包括阴性对照抗体染料试剂D3，所述试剂D3由488驴抗兔IgG荧光二抗及555驴抗鼠IgG荧光二抗组成；所述试剂盒还包括：试剂A:红细胞裂解液；试剂B：4％多聚甲醛固定液；试剂C：含5％胎牛血清和0.5％Triton X‑100的PBS液；试剂E：荧光封片剂；试剂F：PBS液；所述试剂盒还包含操作说明书，所述操作说明书记载以下内容：试剂准备阶段：用试剂C分别按一定比例稀释试剂D1、D2、D3，制成工作液；生精小管玻片制备阶段：(1)取人生精小管，用试剂F漂洗；(2)取出废液，加入试剂B，室温孵育；(3)当血块、血液较多时，弃废液，加入试剂A，室温摇床放置；(4)弃废液，加入试剂F洗涤，重复两次；(5)当染色背景较高时，弃废液，加入试剂C，室温孵育；(6)取出生精小管分成三份，分别放入三个试管中分别放入D1、D2、D3工作液，室温孵育15‑30min；(7)弃废液，加入试剂F洗涤，重复两次；(8)取出生精小管放置在一载玻片上，小心将其尽量铺展开，使用试剂E封片处理，在荧光显微镜下观察，根据观察结果，判断受试者的生精功能情况；所述试剂盒还包含染色结果说明书，所述结果说明书记载以下内容：生精情况的病理分类主要分为三种类型，分别为生精正常、生精阻滞、无生精或生精低下；(1)所述生精正常判断标准为：所有生精小管GFRA1阳性、c‑KIT阳性、SCP3阳性和PNA阳性；(2)所述生精阻滞判断标准为：①所有生精小管GFRA1阳性、c‑KIT阳性、SCP3阳性和PNA阴性；②所有生精小管GFRA1阳性、c‑KIT阳性、SCP3阴性和PNA阴性；③所有生精小管GFRA1阳性、c‑KIT阴性、SCP3阴性和PNA阴性；(3)所述无生精或生精低下判断标准为：①无生精：所有生精小管GFRA1阴性、c‑KIT阴性、SCP3阴性、PNA阴性；②生精低下：所有生精小管GFRA1阳性、c‑KIT阳性、SCP3阳性和PNA阳性但是数量偏低或者生精灶只存在于生精小管的部分区域；另外，试剂D3的染色结果作为阴性对照，根据阴性对照排除生精小管的自发荧光和非特异染色。