[发明专利]一种快速评估睾丸生精功能的免疫荧光染色法及其试剂盒

说明书

本发明提供了一种用于快速评估睾丸生精功能情况的抗体组合、方法及检测试剂盒，所述抗体组合包括：(1)由FITC荧光标记的兔抗人源GFRA1抗体及PE荧光标记的鼠抗人源c‑KIT抗体；(2)由FITC荧光标记的兔抗人源SCP3抗体及PE荧光标记的鼠抗人源PNA抗体。以睾丸生精小管作为检测样品，通过免疫组织化学荧光染色检测样品GFRA1、c‑KIT、SCP3和PNA表达情况判断各级生精细胞是否存在，从而评估患者的生精功能。本发明首次在术中/术后将生殖细胞表面标志物的免疫荧光化学染色用于快速评价患者的生精功能，检测速度快，具有极高的敏感度和可靠的特异度，并且能将各阶段的生精细胞区分开来，对于患者的评估和后续治疗有着重要的价值。

技术领域

本发明涉及生殖医学技术领域，具体地说，是一种用于快速、准确评估睾丸组织生精功能情况的抗体组合、染色方法及其试剂盒。

背景技术

非梗阻性无精子症(Non-obstructive azoospermia，NOA)在不育男性中的发病率约10％，占到无精子症的60％，其特征表现为睾丸组织不同程度的生精损害。非梗阻性无精子症病人的睾丸组织的病理分类主要分为：1.生精低下；2.生精阻滞；3.唯支持细胞综合征；等。目前，手术中(包括睾丸穿刺、睾丸活检和睾丸显微取精术)判断病人睾丸生精情况的方法主要是：将睾丸组织在HTF液(一种人输卵管液模拟物)中尽量剪碎成单个细胞或细胞团块后，将细胞悬液制成玻片放置在带相差的正置显微镜下直接观察，寻找是否有精子及各级生精细胞。这种方法虽然比较简单快速，但是破坏了生精小管的正常结构，因为操作人员是根据各级生精细胞的大小、折光度和核质比等指标进行辨认区分，所以检测结果的准确性很大程度上依赖于检验人员的经验水平，对于术中及术后患者的评估和治疗具有一定的局限性。现阶段临床上使用的另一种评估患者生精功能的方法，也是现行公认的“金标准”是患者睾丸组织的术后石蜡切片的HE染色，但这种方法所需要的准备时间长，患者和医务人员通常需要两周时间才能知道检查结果，对于患者的术中评估以及术后治疗方案的选择不具有即时性。另外，睾丸生精小管是长形的管道结构，管腔内的生精灶并不是均匀分布的，特别是对于生精受损的病人而言，常常会在睾丸整体生精功能下降甚至丧失的情况下仍然保留小范围的局灶性的生精灶，而病理切片是管腔的横断面，所以病理切片能观察到生精灶的概率等于生精灶占整个生精小管长度的比例，当病人生精情况较差，这一比例较小时，病理切片的横断面很容易避开生精灶而导致假阴性的结论。另一方面，对于在手术中将睾丸组织剪碎成单个细胞或细胞团块后放置在带相差的正置显微镜下直接观察的方法，当生精灶占整体生精小管的比例较小时，也可能由于生精细胞被过度稀释导致假阴性的结论。

因此根据现有技术的缺点，有必要研发一种用于评估患者睾丸生精功能情况的方法，可以在术中快速有效查找和区分患者睾丸生精小管内的生殖细胞。

发明内容

本发明的第一个目的是针对现有技术中耗时长或主观性强等不足，提供一种快速、准确评估睾丸组织生精功能的方法。

本发明的第二个目的是针对现有技术中的不足，提供一种用于快速评估睾丸组织生精功能的荧光染色试剂盒。

本发明的第三个目的是针对现有技术中的不足，结合睾丸各种生精细胞的特异性标志物相关规律，提供一种用于快速评估睾丸组织生精功能的抗体组合。

本发明的第四个目的是针对现有技术中结果的解读依赖于操作人员经验的主观判断的不足，提供如上所述抗体组合的用途，并根据染色结果对无精子症患者进行更加细致、客观的分类。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

一种快速评估睾丸组织生精功能的方法，以生精小管作为检测样品，通过免疫组织化学荧光染色检测样品GFRA1、c-KIT、SCP3和PNA表达情况，根据检测结果评估患者生精功能。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：