[发明专利]一种以纳米粒子为佐剂的治疗哮喘的方法

摘要

本发明公开了一种以纳米粒子为佐剂的治疗哮喘的方法，运用基因工程技术首次制备尘螨主要过敏原Der f2‑Der p2融合蛋白，并采用纳米粒子作为佐剂制备出新型尘螨融合蛋白口服纳米疫苗，可望克服以往尘螨疫苗含大量杂蛋白、副作用大、需专反复注射、患者依从性差等问题；通过建立哮喘动物模型，选用以PLGA为佐剂的Der II融合蛋白口服疫苗，首次探讨新型尘螨疫苗免疫治疗的疗效，并观察尘螨纳米口服疫苗在体内吸收和代谢途径；运用分子免疫学和分子生物学技术，对PLGA‑Der II融合蛋白纳米疫苗治疗的机制以及其中起关键作用的信号通路和调控因子进行深入研究，为研制尘螨口服纳米疫苗提供理论依据，进而便于对哮喘病的治疗。

主权项

1.一种以纳米粒子为佐剂的治疗哮喘的方法，其特征在于：包括如下步骤：1)先进行尘螨变应原Der融合蛋白，即Der II的制备及免疫原性鉴定；再通过物理方法即通过超声、磁力搅拌和冷冻干燥制备纳米粒子PLGA‑Der II疫苗，并观察其形态，测定其平均粒径、包封率、载药量、药物释放及稳定性，探索并优化变应原和纳米佐剂最佳结合条件，检测其活性及细胞毒性；ELISPOT检测PLGA对尘螨抗原的免疫原性的影响；最后小鼠活体成像观察荧光标记的PLGA‑Der II尘螨纳米疫苗在体内的代谢途径；激光共聚焦显微镜观察细胞对PLGA‑Der II尘螨纳米疫苗的摄取；2)采用尘螨粗提变应原建立Balb/c小鼠哮喘模型；观察PLGA‑Der II口服纳米疫苗免疫对哮喘动物的治疗效果：设置PLGA对照组，比较不同剂量PLGA‑Der II口服疫苗的疗效；PLGA‑Der II与其他类型尘螨疫苗的比较；免疫治疗疗效评价指标：气道高反应程度；肺泡灌洗液中炎症细胞鉴定，计数；BALF和血清中炎症细胞因子，比如IL‑4、IL10、IFN‑γ浓度，检测血清sIgE水平；观察肺组织炎症细胞浸润情况；脾细胞增殖及细胞因子的变化；3)PLGA‑Der II口服免疫治疗机制包括动物体内试验：检测PLGA‑Der II新型口服疫苗免疫治疗对小鼠DC免疫调节功能的影响，诱导Treg生成及其作用机理；体外细胞培养试验：研究PLGA‑Der II纳米疫苗免疫抑制的信号转导途径；基因敲除实验：验证SHP‑1在PLGA‑Der II纳米疫苗免疫抑制过程中的作用。