[发明专利]一种抑制力学感知蛋白PDLIM3降解的纯化方法

摘要

本发明提供了一种抑制力学感知蛋白PDLIM3降解的纯化方法，首先表达力学感知蛋白PDLIM3；然后破碎菌体，离心收集上清液；接下来重力流Ni凝胶亲和层析；最终采用25‑30kDa截留量的超滤膜，达到抑制力学感知蛋白PDLIM3降解的目的，最终获得高浓度的目标蛋白液。本发明在浓缩过程中降低对力学感知蛋白PDLIM3施加的环境外力，即减小剪切力，从而抑制力学感知蛋白PDLIM3的降解，提高浓度，并保持其活性。本发明大大缩短了力学感知蛋白PDLIM3的浓缩时间，显著提高其浓缩效率，降低时间、经济成本。

主权项

一种抑制力学感知蛋白PDLIM3降解的纯化方法，其特征在于包括下述步骤：第一步，表达力学感知蛋白PDLIM3，将表达菌株接种于培养基中，培养至OD600值为0.4～0.8时，加入摩尔浓度为1M IPTG的母液至IPTG的终摩尔浓度为0.2～0.8mM，继续培养3～8h；在0～4℃温度下，1000～4000rpm离心菌液10～30min，弃掉上清液，收集菌体；第二步，配置摩尔浓度为50mM Tris‑HCl、50mM NaCl、pH8.0的裂解液，用裂解液重悬菌体，菌体与裂解液的质量比为1:5～20；然后加入EDTA终摩尔浓度0.5～1.5mM、PMSF终摩尔浓度0.3～0.7mM、β‑巯基乙醇终摩尔浓度5～15mM、lysozyme终浓度0.5‑1.5mg/mL和甘油终体积浓度3～7％；将溶液混合均匀后，在0～4℃温度下超声破碎细胞0.5～1.5小时，最后在0～4℃下，10000～15000rpm离心10～60min，收集上清液；第三步，用孔径0.22μm的滤膜过滤上清液，然后向滤出物中加入EDTA终摩尔浓度0.5～1.5mM、PMSF终摩尔浓度0.3～0.7mM、β‑巯基乙醇终摩尔浓度5～15mM、甘油终体积浓度3～7％和咪唑终摩尔浓度5～15mM；混合均匀后，加入Ni SepharoseTM6 Fast Flow填料，滤出物与Ni SepharoseTM6 Fast Flow填料体积比为50～200：1，在0‑4℃下旋转混匀1‑6h，使目的蛋白与填料充分结合；采用重力流色谱柱和摩尔浓度为80‑500mM的咪唑溶液对目的蛋白进行洗脱，收集洗脱液；第四步，使用截留分子量25‑30kDa超滤膜的超滤管过滤洗脱液，浓缩目的蛋白。