[发明专利]一种血凝和血凝抑制试验筛选方法

摘要

本发明公开了一种血凝和血凝抑制试验筛选方法，包括以下步骤：抗原和血清的稀释；血凝试验；血凝抑制试验筛选，血凝抑制试验筛选中通过采用1块稀释板和3块反应板，一次性检测80份血清样品，筛选出阳性样品最终判定免疫抗体水平，相较传统方法可节省抗原一半多。本发明用较少的抗原检测较多的样品，达到检测抗体水平高低的目的，检测方法简单，检测结果准确可靠，检测效率高，大大减少了工作量，降低了对实验人员的需求量，很好的解决基层实验室检测经费紧张，检测试剂有限，检测数量大的问题，本发明筛选方法尤其适用于基层农村动物防疫检疫机构，既节约了检测试剂，又加快了检测速度。

主权项

1.一种血凝和血凝抑制试验筛选方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：步骤一：稀释配制1×PBS溶液，抗原和血清开启后，按每瓶标签上所示的产品规格用1ml或2ml PBS溶液充分溶解，备用；所述1×PBS溶液为NaCl 8g，NaH2PO4·2H2O 1.561g，Na2HPO4·12H2O 3.582g，加水至1000ml，调ph值至7.2；步骤二：进行血凝试验(1)在V型微量反应板中，每孔加0.025ml PBS溶液；(2)在第1孔中加入0.025ml抗原，依次作0.025ml的对倍稀释至第11孔；(3)每孔加入0.025ml PBS溶液；(4)每孔加入0.025ml 1％(V/V)鸡红细胞悬液；(5)将反应板在振荡器上震荡1‑2分钟或轻叩反应板混合反应物，20‑25℃静置40分钟，或者是2‑8℃静置60分钟，当对照孔的红血细胞呈显著钮扣状时判定结果；(6)结果判定：将反应板倾斜，观察红细胞有无呈泪滴样流淌，完全无泪滴样流淌即100％凝集的最高稀释倍数为血凝效价；步骤三：进行血凝抑制试验筛选(1)根据步骤二(6)中血凝试验测定的血凝效价，计算配制4单位抗原；(2)选择一块稀释板，即：1:8U型稀释板，记为A板；选择三块反应板，即：1:8V型空反应板，记为B板；第一块V型反应板，记为C板；第2块V型反应板，记为D板；A板、B板、C板和D板均为96孔,孔的排布均为8行×12列；(3)A板中每孔加入0.070ml PBS溶液，抗原对照孔加入0.025ml PBS溶液；(4)C板和D板中全板每孔加入0.025ml PBS溶液；(5)A板中每孔加入0.010ml被检血清样品，血清样品分别用S1、S11、S21……S71；S2、S12、S22……S72；S3、S13、S23……S73；……；S9、S19、S29……S79；S10、S20、S30……S80来表示，被检血清样品加入顺序按S1、S2、S3……S10；S11、S12、S13……S20；……；S71、S72、S73……S80依次加入并混匀；换枪尖，全板加80份样品，并做阳性、阴性、红细胞、抗原对照；a.用8孔移液器从A板中按S1、S11、S21、S31、S41、S51、S61、S71顺序取0.025ml样品混合液依次移入未加PBS溶液的B板的S1、S11、S21、S31、S41、S51、S61、S71孔中，剩余每列孔按此方法作相同的处理，此时B板浓度呈1:8；b.分别用8孔移液器从B板中按S1、S11、S21、S31、S41、S51、S61、S71顺序取0.025ml样品混合液依次移入已加0.025ml PBS溶液的C板的S1、S11、S21、S31、S41、S51、S61、S71孔中，按此方法作相同的处理，将B板中第2列、第3列、第4列、第5列、第6列、第7列、第8列、第9列、第10列孔分别对应于C板剩余的第3列、第5列、第7列、第9列以及D板第1列、第3列、第5列、第7列、第9列孔，然后对C板和D板的第2列、第4列、第6列、第8列、第10列分别对应C板和D板的第1列、第3列、第5列、第7列、第9列做倍比稀释，吹打18‑20次混匀，弃去0.025ml；此时C板和D板浓度均变为1:16和1:32；(6)分别在B板、C板和D板上每孔加0.025ml的4单位抗原，20‑25℃静置40分钟，或者是2‑8℃静置60分钟；(7)分别在B板、C板和D板上每孔加入0.025ml 1％(V/V)的鸡红细胞悬液，轻晃混匀后，20‑25℃静置40分钟，或者是2‑8℃静置60分钟，当对照孔红细胞呈显著钮扣状时判定结果；(8)筛选出阳性被检血清样品,并用筛选出的阳性被检血清样品重新进行血凝抑制试验操作，判定免疫抗体水平。