[发明专利]一种饲料中110种药物的筛查方法

摘要

本发明公开了一种饲料中110种药物的筛查方法，具体包括以下步骤：标准工作溶液的配制、待测样品的分析前处理、数据库的建立和定性分析等，利用液相色谱‑串联四极杆飞行时间质谱仪，高灵敏度的MSMS功能，能够精确的测定出药物中母离子与子离子，快速的判断出添加的药物成分，同时又建立了饲料中多种抗菌药物的检测方法，针对我国饲料行业添加多种抗菌药物具有高效、准确精密的检测手段，目前属于国内领先水平。本发明建立的筛查方法，大大提高了饲料行业中乱填乱加的现象，为检测部门完善了更加精密准确的检测方法，省去更多的时间，节省了大部分的实验耗材，对食品安全及人类健康生活有不可估量的贡献。

主权项

1.一种饲料中110种药物的筛查方法，其特征在于：具体包括以下步骤：所述的110种抗菌药物为：(a)、大环内酯类：泰乐菌素、替米考星、泰妙菌素、阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、罗红霉素、那他霉素、竹桃霉素、螺旋霉素I、吉他霉素；(b)、氟喹诺酮类：恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星、二氟沙星、那氟沙星、司帕沙星、诺氟沙星、恶喹酸、培氟沙星、麻保沙星、奥比沙星、氟甲喹、萘啶酸、西诺沙星、洛美沙星、氧氟沙星、氟罗沙星；(c)、磺胺类：磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺二甲嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺吡啶、磺胺二甲唑、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲异嘧啶、磺胺甲氧嗪、磺胺氯吡嗪、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺异噁唑、苯酰磺胺、磺胺硝苯、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺噻唑；(d)、喹噁啉类：喹烯酮、卡巴氧、乙酰甲喹、喹乙醇；(e)、β‑内酰胺类：氨苄西林、苯唑西林、氟氯西林、头孢匹林、头孢噻肟、头孢氨苄、头孢拉定、头孢噻呋；(f)、林可胺类：林可霉素、克林霉素；(g)、四环素类：土霉素、四环素、金霉素、多西环素；(h)、酰胺醇类：氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考；(i)、硝基呋喃类：呋喃唑酮、呋喃它酮；(j)、硝基咪唑类：奥硝唑、地美硝唑、异丙硝唑、塞克硝唑、甲硝唑；(k)、抗球虫类：氯苯胍、氯羟吡啶；(l)、苯并咪唑类：非班太尔、氟苯达唑、阿苯达唑、芬苯哒唑、奥苯达唑、奥芬哒唑、噻苯达唑、阿苯达唑砜、甲苯达唑；(m)、β‑受体激动剂：克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、氯丙那林、拉贝特罗、班布特罗、喷布特罗、溴布特罗；(n)、镇静剂类：氯丙嗪、氟哌利多、氟哌啶醇、阿扎哌隆、异丙嗪、赛拉嗪、奥沙西泮、硝西泮、地西泮、奋乃静；(o)、抗病毒类：金刚烷胺、金刚乙胺、泛昔洛韦；(p)、其他：甲氧苄啶、阿托品；(1)标准工作溶液的配制：准确称取各标准品10mg，于10mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成1mg/mL各标准贮备液；对于难溶药物，恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星加入少量0.1mol/L HCl溶液，洛美沙星加入少量0.1mol/L NaOH溶液，头孢喹肟、喹乙醇和喹烯酮加适量二甲基亚砜使其溶解后，用甲醇定至刻度；分别量取各标准贮备液1mL，于100mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度为10μg/mL混合标准中间工作溶液；取混合标准中间工作液0.1mL，用乙腈+水混合液稀释，制成1μg/mL混合标准工作液；(2)待测样品的分析前处理：1)称取2±0.02g试样于50mL离心管中，加入6mL提取液，涡旋30s，振荡提取10min，以8000r/min的速度离心5min，移取上清液于10mL离心管中；残渣用4mL乙腈重复提取，离心后合并上清液，作为备用液；2)氨基固相萃取柱，用6mL乙腈活化，移取备用液过柱，收集流出液，用50％乙腈溶液定容至5mL，混匀，过0.22μm微孔尼龙滤膜；(3)数据库建立：确定110种药物的分子式和分子量，将110种药物的混合标准工作液进行液相色谱‑串联质谱测定，得到混合标准工作液的总离子流图，再把每种药物的离子色谱图提取出来，确定每种药物的保留时间；将药物的分子量和保留时间输入MSMS分析系统，对混合标准工作液进行MSMS分析，得到各药物的子离子扫描质谱图，并根据各药物的碎片的断裂机理和断裂难度，确定各药物的特征碎片离子；将各药物的种类、名称、分子式、保留时间和特征碎片离子信息汇总，建立110种药物筛查数据库，如下表所示：表1数据库(4)定性分析：1)对经过步骤(2)所述方法处理的待测样品进行液相色谱‑串联质谱分析，将得到的结果与数据库中的数据进行比较，空白溶剂不能出现与标准溶液相同的离子峰，试样的母离子及特征碎片离子的精确质量数应与标准溶液的一致，偏差均应≤0.05Da，试样色谱峰的保留时间，应与标准溶液的保留时间一致，容许偏差为±0.2min，母离子与碎片离子色谱峰的信噪比(S/N)都在3:1以上，信噪比以峰对峰(PtP)计算，全扫描光谱记录时，试样中特征碎片离子的相对丰度必须超过标准溶液参照的特征离子光谱丰度的10％，筛选出满足定性条件的药物，即为疑似阳性样品；2)对于疑似阳性样品，根据药物的保留时间和分子量编辑MSMS方法，并采集数据，所得到的疑似物质的子离子扫描质谱图，与标准溶液的子离子扫描质谱图进行比较，在相同的条件和相近的浓度下，试样中主要碎片离子相对丰度与标准溶液的相对丰度的允许偏差不超过下表规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物：表2主要碎片离子相对丰度与标准溶液的相对丰度的允许偏差相对离子丰度(％)>50>20～50>10～20≤10允许的最大偏差(％)±20±25±30±50                                                                    ；所述步骤(3)和步骤(4)中的液相色谱分析条件为：采用Waters UPLC^TM BEH C18色谱柱，2.1mm×100mm，1.7μm，有机相比例从初始的2％缓慢变化到95％，以保证所有药物都能有效检出，梯度洗脱程序见下表3：表3色谱梯度洗脱程序注：ESI+：A：0.1％甲酸溶液；B：乙腈，梯度洗脱；ESI‑：A：水；B：乙腈，梯度洗脱；1为即时变化，6为线性变化；所述步骤(3)和步骤(4)中的质谱分析条件如下表所示：表4离子源参数表5筛查质谱方法参数注：亮氨酸脑啡肽实时在线分子量校正，分子量为556.2771(ESI+)/554.2615(ESI‑)，扫描时间0.5s，扫描间隔10s。