[发明专利]一种黑松无菌快速繁殖方法

摘要

本发明涉及一种黑松无菌快速繁殖方法，步骤如下：(1)于春季取黑松针叶基部片段为外植体；(2)接种于MS培养基+6‑BA 2mg/L+NAA 0.05mg/L上诱导产生愈伤组织；(3)将愈伤组织接种于1/2MS培养基+NAA 0.05mg/L+PSK 0.001mg/L上实现其大量增殖；(4)将愈伤组织接种于1/4MS培养基+NAA 0.01mg/L+PSK 0.002mg/L上诱导不定芽分化；(5)将单芽切下接种于1/2MS培养基+NAA0.25mg/L+IBA0.25mg/L上诱导生根；(6)将生根的小绿苗经炼苗后移栽于配方为1/4细沙土+1/4蛭石+1/2腐殖土的基质中进一步生长。本发明在短时间内将愈伤组织大量增殖，再将愈伤组织分化形成再生苗，可实现优良黑松个体的保种和大量繁殖。

主权项

1.一种黑松的无菌快速繁殖方法，其特征在于包括以下步骤：1)外植体的选取：于春季采集树龄在7年以下的黑松顶端幼嫩松枝，将其上的松针拔下，流水冲洗后在超净工作台内进行消毒处理，75％酒精消毒30秒，无菌水洗涤2‑3次，再用20％过氧化氢消毒17‑18分钟，期间不断进行摇晃，无菌水洗涤2‑3次，得到无菌的松针；2)愈伤组织的诱导培养：在无菌条件下将无菌松针的基部切下1cm长的片段，接种于诱导培养基中，于25℃、黑暗条件下进行培养；其中，所述诱导培养基配方如下：以MS培养基为基本培养基，仅添加了蔗糖30g/L、琼脂6.5g/L、6‑BA2mg/L、NAA0.05mg/L；3)愈伤组织的增殖：将诱导出的愈伤组织转接于增殖培养基上，于25℃、光照强度为1500Lux条件下进行培养，使愈伤组织活力增强并大量增殖；其中，所述增殖培养基是以1/2MS为基本培养基，pH＝6.4，仅添加了蔗糖30g/L、琼脂6.5g/L、水解酪蛋白1000mg/L、NAA0.05mg/L、PSK0.001mg/L；4)不定芽的分化培养：将增殖后的愈伤组织转接于分化培养基上，于25℃、光照强度为2500Lux条件下进行培养，促使愈伤组织分化为不定芽；所述分化培养基是以1/4MS为基本培养基，pH＝6.4，仅添加了蔗糖30g/L、琼脂6.5g/L、水解酪蛋白500mg/L、NAA0.01mg/L、PSK0.002mg/L；5)生根培养：将芽高大于1.5cm的不定芽切下，转入生根培养基，于25℃、光照强度为2500Lux条件下进行培养，诱导不定芽生根；所述生根培养基是以1/2MS培养基为基本培养基，仅添加蔗糖30g/L、NAA0.25mg/L、IBA0.25mg/L；6)炼苗和移栽：当种苗扩繁到一定数量后，选取2.5cm以上的小植株进行炼苗、移栽，移栽育苗基质配方为：1/4细沙土+1/4蛭石+1/2腐殖土；60天后小植株成活率能达到90％以上。