[发明专利]一种己烯雌酚的血红蛋白催化化学发光酶联免疫检测方法

摘要

本发明公开了一种己烯雌酚的血红蛋白催化化学发光酶联免疫检测方法，通过对己烯雌酚进行结构修饰，衍生出一个羟基，再与蛋白质载体上的氨基连接将己烯雌酚连接到大分子蛋白质载体上，形成完全抗原后诱导机体产生免疫反应，合成己烯雌酚人工抗原、抗体、己烯雌酚酶标抗原，从而进行ELISA检测。该方法以价廉的牛血红蛋白(Hb)作为过氧化物模拟酶代替辣根过氧化物酶，制备出Hb标记的DES，大大降低了检测成本。

主权项

1.一种己烯雌酚的血红蛋白催化化学发光酶联免疫检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，己烯雌酚单羧基丙基醚的制备与己烯雌酚人工抗原的合成S11，己烯雌酚单羧基丙基醚的制备将己烯雌酚溶于二甲基亚砜中，氮气保护下加入碘化钾和4‑氯丁酸乙酯，其中，己烯雌酚：二甲基亚砜：碘化钾：4‑氯丁酸乙酯的比例为50mg：3mL：1‑2mg：1‑2mL，避光、70‑80℃加热回流，反应24h后，用乙酸乙酯萃取，收集上层溶液，干燥后得到固态物质；向固态物质中加入乙醇使之完全溶解，然后滴加2.0mol/L氢氧化钠溶液，其中，乙醇与氢氧化钠溶液的体积比例是2:1，反应3h后，调节pH至3‑4；加入乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯与乙醇的体积比例是10:1，收集上层溶液，经冷冻干燥后得到己烯雌酚单羧基丙基醚，备用；S12，己烯雌酚人工抗原的合成将己烯雌酚单羧基丙基醚溶解在二甲基亚砜中，加入N‑羟基丁二酰亚胺和1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，其中，己烯雌酚单羧基丙基醚：二甲基亚砜：N‑羟基丁二酰亚胺：1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐＝50mg：2mL：35mg：40mg，30℃条件下搅拌反应10h，得到抗原溶液；将牛血清蛋白溶解于pH 7.4的0.01mol/L PBS缓冲液中，其中，牛血清蛋白：PBS缓冲液的比例为30mg：1mL，得到血清蛋白溶液；将所述血清蛋白溶液加入到所述抗原溶液中，血清蛋白溶液中牛血清蛋白和抗原溶液中己烯雌酚单羧基丙基醚的质量比例为3:1，反应12h，然后调pH至8.5，4℃搅拌过夜，然后将得到的反应液在0.01mol/L、pH 7.4的PBS缓冲液中透析72h，使用的透析袋的截留分子量为15000Da，透析结束后，透析袋内透析液冷冻干燥，得到己烯雌酚人工抗原，备用；S2，己烯雌酚抗体的制备利用己烯雌酚人工抗原为免疫原、选择6‑8周龄BALB/C雌性小鼠进行免疫；按免疫原、免疫剂量进行分组，第3次免疫后一周，自小鼠断尾采血，利用间接竞争酶联免疫吸附法检测小鼠血清内抗体效价及药物抑制情况，选择抗血清效价高、竞争抑制强的小鼠，五免后两周，以双倍蛋白量的免疫原直接腹腔注射加强免疫，3‑5d后取小鼠脾脏中的B淋巴细胞；利用细胞融合技术将B淋巴细胞和骨髓瘤细胞进行融合，筛选出分泌特异性抗体的杂交瘤细胞，通过扩大培养杂交瘤细胞，制备己烯雌酚抗体；S3，己烯雌酚酶标抗原的合成向3mL二甲基亚砜中分别加入50mg己烯雌酚人工抗原、30mg二环己基碳二亚胺和30mg N‑羟基丁二酰亚胺，在25℃避光反应12h，然后1200r/min离心5min弃沉淀，将混合物的上清液于4℃保存；将100mg牛血红蛋白溶解于5mL 0.01mol/L的pH7.4的PBS缓冲液中，逐滴加入4℃保存的混合物的上清液，4℃搅拌反应6h，然后将得到的混合液冷冻干燥，得到己烯雌酚酶标抗原；所述己烯雌酚酶标抗原为牛血红蛋白标记的己烯雌酚人工抗原，所述牛血红蛋白作为过氧化物模拟酶；S4，己烯雌酚化学发光酶联免疫检测利用所述己烯雌酚抗体、己烯雌酚酶标抗原对待测样品进行化学发光酶联免疫检测，获得测试样品中的己烯雌酚含量。