[发明专利]一种测定胶原蛋白分子质量的方法

摘要

本发明涉及到一种胶原蛋白分子质量的测定方法，其特征在于利用凝胶过滤色谱柱结合高效液相色谱法测定胶原蛋白分子质量。对不同分子质量的标准样品进行柱分离分析，由于蛋白质分子质量大小的不同，分子会自大而小依次流出色谱柱，得到峰面积各不相同的色谱峰，因此依据标准样品的保留时间与相对分子质量对数的标准曲线，按照标准样品分子质量的测定方法对胶原蛋白的分子质量进行测定，将测定结果与标准曲线进行比对，可以得到不同胶原蛋白分子质量的变化情况，即胶原蛋白的降解情况。本方法简便快速，准确性高，重复性好，能够直观地反应胶原蛋白的降解情况，为胶原蛋白的分析提供了一种更加简便的方法。

主权项

1.一种测定胶原蛋白分子质量的方法，其特征在于，具体步骤如下：S1、制备标准样品：选用若干分子量分布于40～200kDa的蛋白作为分子质量标准品，所述分子质量标准品的数量大于等于5个；S2、制备检测样品：取待测冻干后的胶原蛋白溶于质量浓度为0.01～0.1％的迭氮钠溶液中，搅拌至充分溶解，4℃静置24～48h，制得胶原蛋白液；所述胶原蛋白液中待测胶原蛋白的终浓度为0.2～10mg/mL；取所述胶原蛋白液，加入等体积的0.02mol/LNaH₂PO₄‑0.2mol/LNa₂SO₄缓冲溶液，其中含质量浓度为0.2％十二烷基硫酸钠，摇床震荡1～5h，过0.45μm水系膜，得到待测胶原蛋白检测样品；S3、样品测定：采用TSK‑gel G4000‑SWxl凝胶过滤色谱柱测定分别步骤S1制得的分子质量标准品及步骤S2制得的待测胶原蛋白检测样品，得到分子量标准品以及胶原蛋白的保留时间；所述TSK‑gel G4000‑SWxl凝胶过滤色谱柱的规格为7.8mm×30.0cm；具体检测条件为：进样量：20μL；进样浓度：0.1～1mg/mL；检测波长：220nm；流动相：0.01mol/LNaH₂PO₄‑0.1mol/LNa₂SO₄缓冲溶液，其中含质量浓度为0.2％十二烷基硫酸钠；洗脱流速：0.2～1mL/min；S4、根据步骤S3测得的分子量标准品保留时间，以标准品分子质量的对数与保留时间做线性回归，得到胶原蛋白分子量标准曲线；将步骤S3得到的待测胶原蛋白的保留时间与标准曲线进行比对，即可得到胶原蛋白的分子质量。