[发明专利]一种循环肿瘤细胞阴性富集方法

摘要

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种循环肿瘤细胞阴性富集方法。采用淋巴细胞分离管基础上的密度梯度离心对血样进行前处理，简化了白细胞分离操作步骤，缩短了循环肿瘤细胞的富集时间，整个操作在2.5h内即可完成；留下的白细胞数量相当于血样原始白细胞数量的30‑50％，对留下的白细胞采用自制阴性富集免疫磁珠CD45标记白细胞并去除，减少了免疫磁珠的用量，大大节约了循环肿瘤细胞阴性富集的成本；本发明采用淋巴细胞分离管对血样进行前处理，并对循环肿瘤细胞阴性富集方法进行改良，有效提高了富集操作稳定性，循环肿瘤细胞的回收率达到85％以上；本发明还具有高灵敏度的优点，可以在数量极少的样品中稳定检出循环肿瘤细胞。

主权项

一种循环肿瘤细胞阴性富集方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：将密度梯度分离液和肿瘤患者血样在淋巴细胞分离管中混合，加入洗涤缓冲液，进行第一次离心；S2：将经过第一次离心的淋巴细胞分离管中挡板上层溶液转移至第一离心管中，进行第二次离心，吸去上清，加入红细胞裂解液，静置；S3：将经过静置后的第一离心管进行第三次离心，吸去上清，加入磁珠孵育缓冲液，再加入阴性富集免疫磁珠，混匀，孵育20‑40min，所述阴性富集免疫磁珠结合有靶向白细胞表面广谱标记物CD45；S4：将上述经过孵育后的第一离心管放置在磁力架上静置，将上清液全部转移至第二离心管中，用洗涤缓冲液冲洗第二离心管；S5：将上述第二离心管进行第四次离心，吸去第二离心管上清液，在第二离心管中加入细胞固定液重悬后涂于载玻片上，过夜干燥，得到干燥的循环肿瘤细胞。