[发明专利]一种循环肿瘤细胞阴性富集方法

说明书

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种循环肿瘤细胞阴性富集方法。采用淋巴细胞分离管基础上的密度梯度离心对血样进行前处理，简化了白细胞分离操作步骤，缩短了循环肿瘤细胞的富集时间，整个操作在2.5h内即可完成；留下的白细胞数量相当于血样原始白细胞数量的30‑50％，对留下的白细胞采用自制阴性富集免疫磁珠CD45标记白细胞并去除，减少了免疫磁珠的用量，大大节约了循环肿瘤细胞阴性富集的成本；本发明采用淋巴细胞分离管对血样进行前处理，并对循环肿瘤细胞阴性富集方法进行改良，有效提高了富集操作稳定性，循环肿瘤细胞的回收率达到85％以上；本发明还具有高灵敏度的优点，可以在数量极少的样品中稳定检出循环肿瘤细胞。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种循环肿瘤细胞阴性富集方法。

背景技术

循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTC)是指自发或因诊疗操作由实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞，是恶性肿瘤患者出现远处转移的主要原因。据统计，转移是超过90％的肿瘤患者的死亡原因。近年来，随着一些基础学科相关技术的不断改进，CTC检测作为一种新型的非侵入性诊断工具，相比传统组织活检具有无创、可多次获取、可实时监测等优势，因此检测CTC被形象地称为“液体活检”，具有重要的临床研究及应用价值，已成为临床研究的热点。已有大量临床研究已经证实：通过对循环肿瘤细胞的检测，可有效地进行对多种肿瘤进行早期诊断、预后判断、监测术后复发、个体化治疗、化疗药物的快速评估、耐药性的监测等。

近10年的大量临床研究表明，检测CTC数量有助于结肠癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌患者的预后评估；当CTC出现上皮间质转换(EMT)、过表达上皮细胞粘附分子(EpCAM)时，往往提示肿瘤患者预后不佳，

临床研究发现，早期发现的癌症患者，90％可以治愈。但是，由于常规检测技术的局限性，早期发现癌症的人群只占少数，我国早期(Ⅰ期)癌症病人约占总体病人数5％-10％，70％的病人都属于晚期发现，这类病人5年生存率仅10％～30％。世界卫生组织早在2006年就指出癌症的防治三原则：早发现、早诊断、早治疗，可见，尽早发现是癌症防治的关键。但是在肿瘤的常规检测手段中，例如CT或核磁共振检查，对小于5毫米的肿瘤诊断比较困难，如胰腺癌、肺癌往往发现确诊以后都是中晚期的。现在发现，很多肿瘤在1毫米的情况下已经可以在血液里查到循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTC)。因此，早期发现微转移不仅对肿瘤复发和预后的判断有重要意义，而且对指导临床治疗也有很大价值。而目前临床肿瘤的发现和诊断仍高度依赖于影像学及血清肿瘤标志物的检查，难以早期发现肿瘤的转移或复发，也难以及时反映疗效。因此，现有肿瘤常规筛查、诊断方法不能满足临床需求，临床迫切需要安全、准确性高、操作方便的癌症筛查、诊断新方法。

血液中循环肿瘤细胞以较低的数量存在于血液中，一般需要富集后才能有效检测和分析。血液中的细胞种类繁多，要绝对准确地鉴定血液中的肿瘤细胞，并不容易。CTC在肿瘤患者外周血中极为稀少，约1～10个/mL，而正常成人外周血中所有血细胞浓度为10⁹/mL，白细胞的浓度是4～10×10⁶/mL。远低于血液中其他类型细胞数量的稀缺性使得CTC在血液检测中极具挑战性。

CTC检测一般包括CTC富集和CTC鉴定两个部分，通常要通过富集的步骤以去除大部分正常细胞，然后再鉴定得到的细胞的确是CTC。CTC的富集方法主要分为物理方法和生物化学方法两大类。CTC的鉴定主要通过细胞形态学或核酸分子水平进行分析鉴定。

CTC的富集方法主要分为物理方法和生物化学方法两大类。物理法基于肿瘤细胞与正常细胞物理性质，如大小、变形性、密度、介电性等的差异，利用外力场比如磁场，流体场，电场等的作用进行分离捕获。生物化学法通常依赖于细胞膜表面的抗原与偶联在分离介质上的抗体相结合，达到分离捕获的目的。