[发明专利]基于SERS位移和强度相结合的糖蛋白检测芯片的应用

摘要

一种基于SERS位移和强度相结合的异质体分辨糖蛋白检测芯片，属于SERS检测技术领域。本发明首次应用抗体纳米金及具有拉曼活性和良好生物相容性的银组装膜作为基底，设计了一个可以读出异质体％的基于表面增强拉曼的三明治结构的蛋白芯片，这种蛋白芯片目前最具潜力的应用是肝癌的早期诊断。在肝癌早期诊断中，这种蛋白芯片对甲胎蛋白(AFP)的高分辨可以大大提高诊断的准确性。而且检测读出异质体％的定量方式首次采用了最新的定量方法(拉曼特征峰的位移)和旧的定量方法(内标和特征峰相对强度)相结合的方式。本发明芯片还可以应用于其他同源异质体蛋白的分辨与检测，可以有效排除由传统免疫方法带来的假阳性和假阴性，同时降低了芯片制作成本。

主权项

1.一种基于SERS位移和强度相结合的异质体分辨糖蛋白检测芯片在检测AFP‑L3％中的应用，其特征在于：该芯片是由如下步骤制备得到，(1)羟基化将硅片放入质量分数95～98％的浓硫酸水溶液和质量分数25～30％的过氧化氢水溶液混合溶液中，两种溶液的体积比7：3，直至溶液不再有气泡出现为止，将硅片取出并用水清洗，然后浸泡在水溶液中；(2)将步骤(1)羟基化得到的硅片浸泡在质量百分数为1～3％的聚二烯基丙二甲基氯化铵PDDA水溶液30～40分钟，取出后用水清洗，氮气吹干；(3)将步骤(2)修饰了PDDA分子的硅片放入银溶胶中浸泡4～6个小时，取出后用水冲洗，氮气吹干，得到表面组装银的SERS纳米芯片；(4)纳米芯片对巯基苯甲酸‑AFP抗体的修饰将步骤(3)制备好的表面组装银的SERS纳米芯片在10^‑3～10^‑4M的对巯基苯甲酸乙醇溶液中浸泡4～6个小时，将纳米芯片取出后用酒精冲洗，氮气吹干；将氮气吹干的纳米芯片再浸泡在0.5～2mg/mL的1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐和N‑羟基琥珀酰亚胺等浓度的混合水溶液中12～15小时，活化羧基；最后将活化羧基的SERS纳米芯片取出后用水冲洗，氮气吹干，再浸泡在30ng/mL的AFP抗体的磷酸缓冲溶液中反应12～15小时，将SERS纳米芯片取出后用磷酸缓冲溶液冲洗，氮气吹干；(5)牛血清蛋白封闭将步骤(4)得到的SERS纳米芯片浸泡在0.1mg/mL的牛血清蛋白的磷酸缓冲溶液中1～3小时，将SERS纳米芯片取出后用磷酸缓冲溶液冲洗，氮气吹干，得到基于SERS位移和强度相结合的异质体分辨糖蛋白检测芯片；利用步骤(5)得到的芯片进行AFP‑L3％检测的步骤如下，A、分别取100μL不同浓度的AFP水溶液于500μL离心管中，将多个步骤(5)制备的蛋白检测芯片分别放入其中，反应12～16小时；取出蛋白芯片后用水冲净，氮气吹干后，放入样品台，分别进行拉曼检测；绘制甲胎蛋白AFP总浓度的对数与该浓度对应的对巯基苯甲酸的特征峰在1075cm^‑1处位移的散点图，再拟合得到标准曲线1；B、将步骤A中的不同浓度的AFP水溶液替换为血清样品水溶液，重复步骤A的操作，得到血清样品的对巯基苯甲酸特征峰在1075cm^‑1处位移，再根据该标准曲线1的线性方程，得到血清样品的AFP总浓度；C、分别取100μL不同浓度的AFP‑L3水溶液于500μL离心管中，将多个步骤(5)制备的蛋白检测芯片分别放入其中，反应12～16小时；取出蛋白芯片后用水冲净，氮气吹干后，重新放入装有400μL磷酸缓冲液的离心管中，分别加入100μL抗体纳米金溶液，继续反应12～16小时；随后将蛋白芯片取出用水冲洗，氮气吹干，放入样品台，分别进行拉曼检测；绘制5,5'‑二硫代双(琥珀酰亚胺基‑2‑硝基苯甲酸)在1340cm^‑1处的特征峰强度与对巯基苯甲酸在1075cm^‑1处的特征峰峰强度的比值与AFP‑L3浓度的散点图，然后进行拟合，得到的标准曲线2；所述的抗体纳米金溶液是将1mL金溶胶8000～15000转/分钟离心5～10分钟后去掉上层清液，然后和100μL、1mg/mL的5,5'‑二硫代双(琥珀酰亚胺基‑2‑硝基苯甲酸)的乙腈溶液混合，反应3～6小时后，加入20μL饱和的AFP‑L3抗体的磷酸缓冲溶液，反应12～16小时，再加入100μL、0.1mg/mL的牛血清蛋白的磷酸缓冲溶液封闭，离心去掉上层清液后用磷酸缓冲溶液重新分散至500μL并保存于4℃冰箱中得到；D、将步骤C中不同浓度的AFP‑L3水溶液替换为血清样品水溶液，重复步骤C的操作，得到血清样品水溶液的5,5'‑二硫代双(琥珀酰亚胺基‑2‑硝基苯甲酸)在1340cm^‑1处的特征峰强度与对巯基苯甲酸在1075cm^‑1处的特征峰峰强度的比值，再根据该标准曲线2的线性方程，得到血清样品的AFP‑L3浓度；E、步骤D得到的AFP‑L3浓度与步骤B得到的AFP总浓度的比值即血清样品中AFP‑L3％。