[发明专利]基于SERS位移和强度相结合的糖蛋白检测芯片的应用

说明书

一种基于SERS位移和强度相结合的异质体分辨糖蛋白检测芯片，属于SERS检测技术领域。本发明首次应用抗体纳米金及具有拉曼活性和良好生物相容性的银组装膜作为基底，设计了一个可以读出异质体％的基于表面增强拉曼的三明治结构的蛋白芯片，这种蛋白芯片目前最具潜力的应用是肝癌的早期诊断。在肝癌早期诊断中，这种蛋白芯片对甲胎蛋白(AFP)的高分辨可以大大提高诊断的准确性。而且检测读出异质体％的定量方式首次采用了最新的定量方法(拉曼特征峰的位移)和旧的定量方法(内标和特征峰相对强度)相结合的方式。本发明芯片还可以应用于其他同源异质体蛋白的分辨与检测，可以有效排除由传统免疫方法带来的假阳性和假阴性，同时降低了芯片制作成本。

技术领域

本发明属于SERS检测技术领域，具体涉及一种基于SERS位移和强度相结合的异质体分辨糖蛋白检测芯片。

背景技术

许多疾病经常与糖蛋白的变异有关(如高尔基体糖蛋白73、血小板膜活化糖蛋白、血清酸性糖蛋白等)，使得检测糖蛋白变得至关重要。以肝癌标记物甲胎蛋白(AFP)为例，AFP是一种胚胎蛋白，也是一种糖蛋白，在胚胎1-2个月时主要由卵黄囊和肝脏合成，之后主要由肝脏合成。3月龄时血清AFP含量达到最高峰，约为3000ng/mL，随着分娩的临近，血清中AFP水平呈直线下降。出生后1-2年降至正常成人水平。在胚胎时期，AFP是血清中的正常成分，可能起着与血清白蛋白相似的作用。在成年人阶段因其合成通常受到抑制故血清中含量甚微，一般不超过20ng/mL，绝大多数低于5ng/mL。若成人血清 AFP含量升高，则往往是疾病的表现。常见于畸胎瘤及各种原因引起的急慢性肝炎、肝硬化、尤其是肝癌，偶见于其他肿瘤如胃肠道肿瘤、肺癌、结肠癌、胰腺癌、胆囊癌。

鉴于AFP与肝癌的密切关系，许多学者对AFP的应用进行了多方面的研究，其重点是AFP在肝癌的早期诊断、药物疗效观察、手术是否彻底、有无远处移、患者的预后判断以及基因治疗等方面的应用。AFP发现至今的三十多年里，其检测方法不断得到改进，特异性和灵敏度不断提高，对肝癌的诊断日趋精确。除了目前常用的酶联免疫分析法和放射免疫分析法外，检测血清AFP曾经使用过的方法有琼脂免疫扩散、免疫对流电泳、反向间接血凝、放射免疫火箭电泳自显影等方法，这些方法要么灵敏度低，要么方法复杂，现已淘汰。

研究工作已经证实肝部病变产生的AFP与正常的AFP在糖基链上存在不同，通过AFP与小豆凝集素的作用强弱，可以将AFP分成三类：AFP-L1、AFP- L2，AFP-L3。人们研究发现，AFP-L1主要存在于胚胎阶段的细胞当中，属于正常人的甲胎蛋白；AFP-L2来自于怀孕的母体分泌的甲胎蛋白；而AFP-L3是肝癌细胞特异性产生的蛋白，如果检测AFP总浓度，这个浓度既包含需要检测的 AFP-L3也包含了非特性异性的AFP-L1和AFP-L2的浓度，特异性的降低的同时，也使蛋白芯片产生了很严重的假阳性结果。在诊断学中，认为当异质体 AFP-L3占AFP总量超过10％时，可以诊断为早期肝癌，随后成为一种新的诊断指标AFP-L3％，即异质体％。因此发展一种可以读出AFP-L3％的异质体分辨的蛋白芯片具有十分重要的意义和应用前景。

表面增强拉曼散射(SERS)是一种超灵敏的表面分析技术，借助分子在 SERS活性基底的吸附可将分子本身的拉曼信号显著增强。在一些特殊体系中， SERS的增强因子可以达到10¹⁴-10¹⁵，使单分子检测成为可能。经历了30年的发展，近年来SERS已被广泛应用在表面吸附、电化学和催化反应、生物医学检测等诸多领域。由于水对信号无影响，使得拉曼光谱受到生物科学工作者的青睐。与其他超灵敏检测技术相比，拉曼光谱有其自身的优点：1)极高的检测灵敏度：可以实现单分子检测，对拉曼信号较弱的蛋白质检测提供了一种非常好的方法。2)极高的选择性：表面选择定则和共振增强的选择性使得SERS可以在极其复杂的体系中只增强目标分子或集团。3)微区与原位检测：光学检测，样品尺寸可以小到微米级。4)无损检测：采用的是可见光，对材料和人体都是非破坏性的。