[发明专利]一种测定丝氨酸蛋白酶抑制剂活性的方法

摘要

本发明提供一种测定丝氨酸蛋白酶抑制剂活性的方法。本发明还提供了所述的方法在丝氨酸蛋白酶抑制剂的生产过程中用于活性控制或定量和稳定性中的用途。与现有技术相比，本发明提供的方法具有以下优点：1)本发明提供的方法步骤简单、使用标准品进行质控、酶动力学动态监测、实验数据清晰，实验结果准确，适用于各种来源的丝氨酸蛋白酶抑制剂原液和制剂的质量标准控制。2)本发明提供了的方法不仅准确度高、精密度及稳定性也大大提高。3)本发明提供的方法，无需使用终止剂。

主权项

1.一种测定丝氨酸蛋白酶抑制剂活性的方法，所述方法包括以下步骤：1)使用去离子水制备浓度为1‑2mmol/L的生色底物水溶液；优选地，所述生色底物选自S2765、BAEE和BAPNA；2)使用稀释液制备活性为0.38‑0.57U/L的丝氨酸蛋白酶溶液；优选地，所述稀释液为1mmol/L的HCl、去离子水、Tris盐酸缓冲液、磷酸缓冲液或硼砂氯化钙缓冲液；所述丝氨酸蛋白酶选自胰酶、纤溶酶和激肽释放酶；3)使用缓冲液制备丝氨酸蛋白酶抑制剂标准品；使用缓冲液制备浓度为0.5‑2.5μmol/L的供试品；优选地，所述供试品为rPI‑T1；优选地，所述缓冲液选自pH为7.0‑8.0、浓度为20‑150mmol/L的Tris盐酸缓冲液，pH为7.2‑7.8、浓度为20‑150mmol/L的磷酸缓冲液或pH为7.0‑8.0、浓度为20‑50mmol/L的硼砂氯化钙缓冲液；优选地，所述制备丝氨酸蛋白酶抑制剂标准品的浓度梯度为0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40PIU/mL；进一步优选地为0、0.05、0.10、0.15、0.20PIU/mL；4)在比色皿中加入步骤2)制得的丝氨酸蛋白酶溶液，然后分别加入等体积的步骤3)制得的不同的浓度梯度的丝氨酸蛋白酶抑制剂标准品，再加入步骤1)制得的生色底物水溶液，随后使用pH为7.4、浓度为50mmol/L的Tris‑HCl缓冲液补充至终体积为1mL，混匀，于36‑38℃孵育1‑40分钟，在波长405nm处检测吸光度，每20‑40秒读数一次，共检测4‑10分钟；优选地，在比色皿中加入20μL步骤2)制得的丝氨酸蛋白酶溶液，然后分别加入20μL的步骤3)制得的不同的浓度梯度的丝氨酸蛋白酶抑制剂标准品，再加入80μL步骤1)制得的生色底物水溶液；5)以丝氨酸蛋白酶抑制剂标准品的活性(PIU/ml)为横坐标，以A405对应时间(秒)的变化率为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准方程，其R≥0.99，将供试品测得的斜率带入标准方程中，计算出活性。