[发明专利]一种测定丝氨酸蛋白酶抑制剂活性的方法

说明书

本发明提供一种测定丝氨酸蛋白酶抑制剂活性的方法。本发明还提供了所述的方法在丝氨酸蛋白酶抑制剂的生产过程中用于活性控制或定量和稳定性中的用途。与现有技术相比，本发明提供的方法具有以下优点：1)本发明提供的方法步骤简单、使用标准品进行质控、酶动力学动态监测、实验数据清晰，实验结果准确，适用于各种来源的丝氨酸蛋白酶抑制剂原液和制剂的质量标准控制。2)本发明提供了的方法不仅准确度高、精密度及稳定性也大大提高。3)本发明提供的方法，无需使用终止剂。

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体而言，本发明涉及一种测定丝氨酸蛋白酶抑制剂活性的方法。

背景技术

丝氨酸蛋白酶，是一类以丝氨酸为活性中心的重要的蛋白水解酶，它们的作用是水解大分子蛋白质中的肽键，使之成为小分子蛋白质。丝氨酸蛋白酶抑制剂几乎存在于所有生物体中，并在生物体内与相应的丝氨酸蛋白酶形成一个动态的系统，对一系列生理过程起着调控作用。当前已知的丝氨酸蛋白酶抑制剂已超过1500种，分为17个蛋白家族，其中包括胰腺蛋白酶抑制剂(Kunitz)家族、胰腺分泌类胰蛋白酶抑制剂(Kazal)家族、链霉菌枯草杆菌蛋白酶抑制剂家族等。丝氨酸蛋白酶抑制剂各成员的抑制专一性是由活性位点P1决定的，且与被抑制的酶的特异性切点一致。丝氨酸蛋白酶抑制剂最基本的功能是防止不必要的蛋白水解，调节丝氨酸蛋白酶的水解平衡，其在生物体内血液凝结、免疫反应、纤溶、血管发生、炎症和肿瘤抑制等一些列生理过程中起重要作用。

丝氨酸蛋白酶抑制剂活性测定是基于蛋白酶活性测定方法，通过测定被抑制后酶的残留活性计算出抑制剂的活性。抑制剂活性单位定义为能抑制2单位酶活性50％时所需要的抑制剂的量为1个抑制剂单位。

现有技术中，常见的测定丝氨酸蛋白酶活性的方法为滴定法和发色底物法。

滴定法是利用化学反应的定量关系，根据消耗标准溶液的体积确定待测物的含量，间接测定酶的活性。此法的缺点是：1、点对点的对比测定，准确性受测定人经验影响较大。2、用标定好的碱滴定蛋白酶水解反应产生的酸，通过计算间接测得酶的活性，步骤多，影响因素多。例如抑肽酶在药典当中的活性测定法为滴定法，该方法准确度不高，操作繁琐，试剂消耗量大，耗时较长，不利于实现自动化，近年来滴定法在我国药典中作为标准的生物药物的分析方法逐渐被其他方法所替代。

发色底物法分为固定时间法和连续监测法，固定时间法起始于20世纪50年，通过加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等，使反应完全停止，才能测定底物或产物的变化，此法必须保证酶和底物在选定温度下作用时间要很精确，否则引起较大误差。

鉴于上述滴定法和固定时间法的局限性，寻找一种更为科学、准确、精密的活性测定方法成为丝氨酸蛋白酶抑制剂制备成药品整个工艺中质量标准的应用的关键。

发明内容

因此，本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种测定丝氨酸蛋白酶抑制剂活性的方法。本发明所述的方法特异性好、精密度高、操作简单，特别适用于丝氨酸蛋白酶抑制剂活性的测定，从而可以在丝氨酸蛋白酶抑制剂生产过程中用于原液和制剂的质量控制和稳定性考察。

除非特别说明，在本发明中丝氨酸蛋白酶酶活性单位定义：在37℃，pH为7.4的条件下，丝氨酸蛋白酶与带有发色基团对硝基苯胺(PNA)的发色底物孵育一定时间后，每分钟能水解底物产生1μmol/L的PNA，定义为一个酶活力单位，单位表示方法胰蛋白酶为TU(Trypsin Unit)、纤溶酶为PU(Plasmin Unit)、激肽释放酶为KU(Kallikrein Unit)，以此类推。

利用公式1计算所述丝氨酸蛋白酶活力：

公式1：

式中：ν-反应速度(μmol/min)；△A-吸光值变化；V-反应体积(L)；1-光程(cm)；t-反应时间(min)；ξ-摩尔吸光系数，10500(L/mol·cm)。