[发明专利]一种牛奶中四环素残留表面增强拉曼光谱检测方法

摘要

本发明涉及一种基于适配体的牛奶中四环素残留表面增强拉曼光谱检测方法。该方法为：以制备的修饰对巯基苯胺标记分子的金纳米颗粒/二氧化硅核壳复合纳米材料作为表面增强拉曼基底，以加标回收率测定的方式实现牛奶中四环素残留的检测研究。制备的牛奶中四环素表面增强拉曼光谱检测方法，当四环素存在时，影响适配体在检测体系中的结构，与适配体发生特异性识别结合，从而引起不同浓度增强基底在不同浓度四环素存在下的释放，随后对检测体系进行磁性分离，将含有磁性微球‑适配体‑四环素复合物吸附至底，对含有不同浓度增强基底的上清液进行拉曼信号测定，依据不同拉曼强度的标记分子特征峰图谱，实现对牛奶中四环素残留灵敏间接检测的目的。

主权项

1.一种基于适配体的牛奶中四环素残留表面增强拉曼光谱检测方法，其特征在于，该方法包括如下具体步骤：1)磁性微球制备：利用溶剂热法合成磁性微球，首先，称取1.350gFeCl3·6H2O，3.854g醋酸钠，0.400g柠檬酸钠溶解在装有70mL乙二醇的250mL三口圆底烧瓶中，随后，上述溶液在氩气保护下加热到300℃，并持续反应1h，形成均匀的黑红色溶液；待溶液冷却至室温，将其转移到至100mL聚四氟乙烯内衬不锈钢反应釜中，在200℃下密封、加热反应17小时；最后，通过磁分离收集的方法，以乙醇和超纯水清洗多次，最后分散至10mL乙醇中，得到黑色磁性微球待用；随后在磁性微球表面修饰PMAA壳，修饰之前，首先在其表面修饰改性聚苯乙烯MPS，具体操作步骤为，将40mL乙醇、10mL超纯水、1.5mL氨水及0.3g MPS添加至上述10mL磁性微球乙醇溶液中，并在60℃水浴环境下磁力震荡反应24h；最后，利用蒸馏沉淀聚合法以甲基丙烯酸AA、甲叉双丙烯酰胺MBA作为交联剂，偶氮二异丁腈AIBN为引发剂，在乙腈溶剂中制备表面修饰PMAA壳的磁性微球；2)磁性微球‑适配体制备：具有羧基表面的磁性微球和具有氨基表面的核酸适配体利用缩合反应制备得到磁性微球‑适配体螯合物；具体操作步骤为：取1mL羧基化的磁性微球分散至2mL EDC水溶液中，随后，将含有1mL1μM核酸适配体的PBS溶液加入至上述溶液中混合反应12h，最终得到磁性微球‑适配体捕捉探针；3)增强基底制备：将制备的金纳米颗粒AuNPs与对巯基苯胺PATP乙醇溶液室温下反应约4h，得到Au/PATP；随后，将APTMS逐滴加入混合溶液中，反应15min后，将5mL硅酸钠加入溶液中，在90℃水浴环境下反应30min，得到增强基底待用；4)核酸适配体互补链‑增强基底制备：搅拌15分钟后，将增强基底进行离心分离，弃上层液体，获得的沉淀用乙醇和乙腈分别清洗三次，在60℃下干燥1h，随后与溶解在乙腈溶剂中的三聚氯氰连续搅拌反应4h；此后，将产物进行离心，弃上层液体，获得的沉淀用乙腈、超纯水、硼酸盐缓冲液BBS分别清洗3次；最终产物再分散在BBS溶液中，将0.4mL核酸适配体互补链BBS溶液加入其中，室温下轻微震动连续反应过夜；5)拉曼光谱检测：首先，将制备的磁性微球‑适配体与信号分子混合，37℃下连续震荡反应2h；随后，分别取200μL磁性微球‑适配体/核酸适配体互补链‑增强基底生物螯合物分装至一系列平行离心管中，随后，将100μL不同浓度的待检物四环素原液依次加入到上述离心管中，混合溶液37℃条件下连续震荡反应70min；以加有100μL超纯水的离心管作为对照组；反应结束后，利用磁铁进行磁性富集，同时利用拉曼光谱在150cm‑1‑2000cm‑1波长范围内对含有不同浓度增强基底的上清液拉曼强度进行测定；6)牛奶中四环素加标回收率测定：利用加标回收结合基于适配体的牛奶中四环素残留表面增强拉曼光谱检测方法实现液态牛奶样本中的四环素检测；检测前需要对样本进行预处理；首先取5ml牛奶于10℃，7000g转速下离心10min，弃去上层乳脂，将沉淀用超纯水稀释20倍，静置后将上清液用过滤器过滤，收集滤液；随后，分别在装有10mL滤液的离心管中加入不同浓度的四环素，然后取分别从每个离心管中取100μL混合液于分装有200uL检测体系的1.5mL离心管中，混合反应70min后，进行磁性分离，测定上清液拉曼光谱强度。