[发明专利]一种特异性的检测弓形虫的方法

摘要

本发明公开了一种特异性的检测弓形虫的方法。所述方法包括以下步骤：1、重构弓形虫SAG1和SAG2抗原表位基因序列；2、连接转化目的基因和载体；3、重组质粒的表达纯化；4、表达重组蛋白；5、Western blot检测重组蛋白的免疫原性；6、ELISA法分析重组蛋白的免疫原性。所述方法灵敏度高，操作简单且无二次污染。

主权项

1.一种特异性的检测弓形虫的方法，包括以下步骤：1)、重构弓形虫SAG1和SAG2抗原表位基因序列同SEQ ID NO:1所示；2)、将目的基因与PET‑28a(+)载体连接后，转化至感受态细胞，挑取完整单个菌落于LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；之后进行菌液PCR、双酶切和测序鉴定；3)、菌液振荡培养至OD值为0.6—0.8时，加入IPTG诱导，于诱导前和诱导后1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h和8h分别收集菌液，离心，加入1×PBS进行SDS‑PAGE电泳，确定最佳的表达时相；4)、将诱导后的菌液离心，收集沉淀，用1×PBS重悬，反复冻融3次后，冰浴超声破碎后离心，收集上清，沉淀用尿素重悬，之后进行SDS‑PAGE电泳，对蛋白可溶性进行分析；使用His亲和层析柱对表达的重组蛋白进行纯化，收集各段洗脱液样品；5)、将纯化后的带有His标签的重组蛋白进行SDS‑PAGE电泳，电转移至NC膜上，用脱脂奶粉封闭2h，PBST洗涤，加入1:100稀释的小鼠弓形虫阳性血清，4℃孵育过夜，同样方法洗涤，加入1∶2000稀释的羊抗鼠IgG‑HRP，室温孵育1h，洗涤后，HRP‑DAB底物显色液显色；6)、将纯化后的rSAG蛋白分别稀释至10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL和1.25μg/mL，每孔加入100μL，4℃包被过夜，PBST洗涤，之后用脱脂奶粉封闭2h，洗涤后，将阳性血清及阴性血清按浓度比为1:50、1:100、1:200、1:400和1:800进行倍比稀释，100μL/孔，每个稀释度做两个重复，37℃孵育1.5h，之后洗涤；加入1：2500稀释的羊抗鼠HRP‑IgG，75μL/孔，37℃孵育1h，洗涤后加入TMB进行显色10min，之后每孔加入2mol/L H2SO4终止反应，测OD450值。