[发明专利]一种特异性的检测弓形虫的方法

说明书

本发明公开了一种特异性的检测弓形虫的方法。所述方法包括以下步骤：1、重构弓形虫SAG1和SAG2抗原表位基因序列；2、连接转化目的基因和载体；3、重组质粒的表达纯化；4、表达重组蛋白；5、Western blot检测重组蛋白的免疫原性；6、ELISA法分析重组蛋白的免疫原性。所述方法灵敏度高，操作简单且无二次污染。

技术领域：

本发明涉及一种免疫检测方法，具体涉及一种特异性的检测弓形虫的方法。

背景技术：

弓形虫属真球虫目，弓形虫科，是一种分布广泛的专性细胞内寄生虫，最早发现于1908年。该病呈世界性分布，广泛存在于温血动物中，其中猫科动物为其终宿主和重要的传染源。弓形虫感染人体后可使患者出现急性弓形虫脑炎而死亡。感染家畜后主要表现出流产、产死胎和弱畜，给人类和养殖业造成严重威胁。弓形虫速殖子是机体免疫系统识别的主要部位，其表膜蛋白抗原(SAG)由SAG基因家族编码。SAG1位于弓形虫速殖子表面，可以诱导宿主的免疫应答；SAG2是速殖子表膜的另一主要抗原，可介导弓形虫速殖子的入侵，这两种抗原均具有较强的免疫原性。目前，对血清特异性抗体进行检测时常用的是虫源性粗抗原，因其成分复杂，导致特异性较差，并容易产生交叉感染，最终影响检测效果。

目前国内外学者多用从感染动物中收集或经组织、细胞培养的弓形虫速殖体作为抗原，该方法虽然操作方便，特异性较好，但抗原纯度较低，成分复杂，容易出现交叉反应。而在原核表达系统中表达出的特异性目的蛋白，因蛋白产量高、操作简单、费用低廉等优势，成为众多学者研究的对象。因此，建立一种重组抗原作为诊断抗原检测弓形虫病的方法势在必行。

SAG1和SAG2抗原都是弓形虫速殖子期特异性表膜抗原，以糖磷脂酰化形式锚定在细胞膜上，以阻止吞噬细胞对侵袭的弓形虫进行吞噬消化。SAG1主要与弓形虫毒力相关，并己证实该基因编码的重组抗原可作为诊断抗原，用于弓形虫速殖子感染的免疫学检测；SAG2与弓形虫入侵宿主细胞有密切的关系，SAG2抗原可以使弓形虫固定于有核细胞的表面，并辅助弓形虫进入有核细胞，介导弓形虫速殖子的入侵过程。有研究表明，弓形虫感染后的血清抗体能够识别SAG1和SAG2表面抗原，抗SAG2蛋白抗体也可以阻断弓形虫的再定位，还有可能在弓形虫速殖子向缓殖子转化的过程中起作用，因此重组蛋白的表达对于蛋白疫苗的制备意义重大。

发明内容：

本发明的目的在于，提供一种特异性的检测弓形虫的方法。本发明方法对弓形虫抗原基因进行生物学分析，设计并合成弓形虫膜表面抗原SAG1和SAG2重构基因，将目的基因与PET-28a(+)表达质粒连接，并成功转化至大肠埃希氏杆菌BL21(DE3)中表达，得到带有His标签的融合蛋白，通过His亲和层析柱对融合蛋白进行纯化，获得高浓度、高纯度的目的蛋白，之后用1×PBS溶液对纯化后的蛋白进行透析。Western blot检测结果显示，表达后融合蛋白可以与小鼠弓形虫阳性血清发生特异性结合；ELISA检测结果显示，不同稀释倍数的融合蛋白与不同浓度的小鼠阳性血清均可发生反应，并能很好的区分阴性阳性血清，说明该融合蛋白具有较好的免疫原性，为弓形虫诊断方法的建立及相应核酸疫苗的研发奠定基础。

为解决上述问题，本发明采用以下技术方案：

一种特异性的检测弓形虫的方法，包括以下步骤：

1、重构弓形虫SAG1和SAG2抗原表位基因序列

重构弓形虫SAG1和SAG2抗原表位基因序列如SEQ ID NO:1所示。

2、连接转化目的基因和载体

将目的基因与PET-28a(+)载体连接后，转化至BL21(DE3)感受态细胞，挑取完整单个菌落于LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。之后进行菌液PCR，双酶切、测序鉴定。

3、重组质粒的表达纯化