[发明专利]一种高粱体细胞悬浮培养方法及应用

摘要

本发明公开了一种高粱体细胞悬浮培养方法，具体包括以下步骤：高粱种子先用70％乙醇浸泡1‑3min，再用无菌水冲洗，然后用0.1g/100mL的HgCl2水溶液浸泡10‑20min，HgCl2水溶液浸泡过程中加入2滴吐温‑20，最后无菌水冲洗，得到无菌高粱种子；制备高粱愈伤组织；选取合适的愈伤组织接种于液体培养基中培养，每隔7天继代一次，每次继代时，将新、旧液体培养基以体积比为2：1的比例混合后作为继代培养的培养基，总共培养42‑45天后获得高粱体细胞悬浮系。本发明的细胞悬浮培养方法，愈伤诱导率高，建立的细胞悬浮系不褐化，容易观察，且悬浮细胞系细胞密度大，游离细胞体积小，细胞质浓厚，近圆形细胞比例达70％以上，活细胞率达60％以上，细胞分裂生长旺盛。

主权项

1.一种高粱体细胞悬浮培养方法，其特征在于，具体包括以下步骤：步骤1，高粱种子的处理：高粱种子先用70％乙醇浸泡1‑3min，再用无菌水冲洗，然后用0.1g/100mL的HgCl2水溶液浸泡10‑20min，HgCl2水溶液浸泡过程中加入2滴吐温‑20，最后无菌水冲洗，得到无菌高粱种子；步骤2，制备高粱愈伤组织，具体包括：将无菌高粱种子接种于无菌苗培养基中，于25±1℃培养，每天光照12h；培养到高粱无菌苗苗长为3‑5cm时取出，将距离叶基1.0cm以上的叶片切成宽度为1mm的叶段，并将叶段接种于诱导培养基中，在25±1℃下培养愈伤，自然光照，20‑30天后挑选状态良好的愈伤组织进行继代培养，继代培养温度为25±1℃，自然光照，直至得到高粱颗粒状愈伤组织；所述无菌苗培养基为：每升MS培养基中添加30g的蔗糖和8g的琼脂，pH为5.8；所述继代培养的培养基与诱导培养基相同，均为：每升MS培养基中添加1mg的2,4‑D、30g的蔗糖和8g的琼脂，pH为5.8；步骤3，高粱体细胞悬浮系的建立：选取步骤2中疏松、干燥、易碎、生长旺盛、颗粒状的高粱愈伤组织接种于液体培养基中，接种比例为2‑3g:100mL，于100r/min、25±1℃、自然光下培养，每隔7天继代一次；每次继代时，将新、旧液体培养基以体积比为2：1的比例混合后作为继代培养的培养基，总共培养42‑45天后获得高粱体细胞悬浮系；所述液体培养基为：每升MS培养基中添加1mg的2,4‑D和30g的蔗糖，pH为5.8。