[发明专利]一种富含氨基的微孔聚合物材料富集糖肽的方法

摘要

本发明涉及一种富含氨基的微孔聚合物材料的糖肽富集方法。本方法使用几种富含氨基的微孔聚合物材料，利用含有唾液酸糖肽和中性糖肽的蛋白酶解液作为样品，采用柱固相萃取模式(SPE)或分散固相萃取模式(dSPE)，应用亲水作用和静电作用的原理，通过优化流动相中有机相和水相的比例以及在流动相中添加酸和缓冲盐等来调节流动相的pH值，实现了对糖肽的选择性富集。该方法具有通量高、选择性好、吸附量大、灵活性强、操作简便、覆盖糖肽范围广等优点，可用于标准品和复杂样品的糖肽富集。 1

主权项

1.一种富含氨基的微孔聚合物材料富集糖肽的方法，基于三聚氰胺与含有醛基、羟基、氨基中的一种或二种以上的功能单体的聚合物材料用于糖肽富集，该聚合物能实现对糖肽的富集。

2.按照权利要求1所述的方法，特征在于：该聚合物材料由功能单体三聚氰胺和下列任意一种或二种以上功能单体组成：

3.根据权利要求2所述的方法，其特征是：基于三聚氰胺的聚合物材料应用在糖肽的富集和纯化方面；材料的结构如下中的一种或二种以上：

4.按照权利要求3所述方法，其特征在于：

富集材料中三聚氰胺与功能单体的摩尔比为1:1；聚合度范围为100‑10000。

5.如权利要求1‑4任一所述的方法，其特征在于：富集材料形貌为无定型或者球形,孔径为2‑50nm；将所述聚合物材料作为富集材料，采用柱固相萃取模式(SPE)或分散固相萃取模式(dSPE)富集和纯化糖肽；

在SPE模式下，首先将聚合物材料加载到末端带有筛板的SPE小柱上，先用洗脱液冲洗材料，然后采用上样液平衡材料，之后将溶解在上样液中的样品加载到富集材料上，采用淋洗液冲洗材料除去非糖肽，最后用洗脱液洗脱材料上的糖肽；在dSPE模式下，将富集材料置于离心管中，先用洗脱液冲洗材料，然后采用上样液平衡材料，之后把材料与溶解在上样液中的样品混合，孵化后，离心弃上清液，所剩沉淀部分用淋洗液冲洗，振荡后，离心弃上清液，沉淀部分用洗脱液洗脱糖肽，振荡后，离心取上清液即得糖肽。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：

上样液组成为缓冲盐溶液和/或酸水溶液与有机溶剂的混合液，有机溶剂的体积比例为70‑85％，pH在1‑5范围内，缓冲盐的浓度为0‑50mM，酸水溶液中酸的质量浓度为0.1％‑5％；

淋洗液组成为缓冲盐溶液和/或酸水溶液与有机溶剂的混合液，有机溶液的体积比例为55‑80％，pH＝1‑5，缓冲盐的浓度为0‑50mM，酸水溶液中酸的质量浓度为0.1％‑5％；

洗脱液组成为缓冲盐溶液与有机溶剂的混合液，有机溶剂的体积比例为0‑50％，pH值在1‑5或10‑14范围内，缓冲盐的浓度为0‑50mM。

7.按照权利要求5所述方法，其特征在于，所用的蛋白酶解液样品应去盐旋干，重溶于上样液，蛋白酶酶解液样品重溶后的浓度为0.01‑10mg/mL，样品的上样量与聚合物材料量之间的体积比例为1:20‑1:1000，实验操作温度为15‑60摄氏度。

8.按照权利要求5或6所述方法，其特征在于，冲洗材料所用洗脱液的体积为材料体积的3‑100倍，平衡材料所用的上样液体积材料体积的3‑100倍，上样体积为材料体积的5‑200倍，淋洗材料所用的淋洗液体积为材料体积的5‑200倍，洗脱糖肽所用的洗脱液体积为材料体积的5‑10倍。

9.按照权利要求5所述方法，其特征在于，采用dSPE方法富集糖肽，振荡转数为100‑2500rpm，样品与材料之间的孵化时间10‑120分钟，孵化温度为15‑60度。

10.按照权利要求5或6所述方法，其特征在于，有机溶剂包括但不局限于乙腈、甲醇、乙醇、四氢呋喃、甲苯等中的一种或二种以上，缓冲盐包括但不局限于甲酸铵、乙酸铵、碳酸氢铵(用缓冲盐酸根离子相应的酸调节到一定的pH范围内)等，酸包括但不局限于甲酸、乙酸、三氟乙酸、乳酸、羟基乙酸等中的一种或二种以上。