[发明专利]一种基于双通道荧光强度同时探测的荧光共振能量转移效率的快速测量方法

摘要

本发明公开一种基于双通道荧光强度同时探测的荧光共振能量转移效率的快速测量方法。该方法是在不需要选择性激发供体和受体，而且也不需要选择性收集探测供体和受体荧光的情况下实现快速FRET定量成像检测。因此，该方法对仪器的配置要求不高，成本低，而且测量过程只需要切换一次激发光，因而具有能够快速实时动态测量的优点，可实现毫秒时间尺度的快速FRET定量显微成像检测。因此，本发明对于活细胞FRET定量实时动态检测具有重要的应用价值，必将极大地推动FRET定量检测技术在细胞生物学中的应用。

主权项

1.一种基于双通道荧光强度同时探测的荧光共振能量转移效率的快速测量方法，其特征在于包括以下的具体步骤：(1)利用两种不同波段的激发光分别激发单供体样本并进行双通道同时荧光成像，分别得到和通过如下公式得到供体的激发吸收比率系数v_D和发射分布系数u_D；所述的和表示分别采用两种不同波段的激发光激发供体样本时在探测通道1和2测量的荧光强度，上标1和2分别表示两种不同波段的激发光，下标1和2分别表示两个探测通道，D表示单转供体样本；其中表示两种不同波段的激发光对应的激发光的强度，表示在两种不同波段的激发光激发下供体对应的消光系数；上标i表示激发波段λⁱ，i＝1，2；下标j表示探测通道j，j＝1，2；(2)利用两种不同波段的激发光分别激发单受体样本并进行双通道同时荧光成像，分别得到和通过如下公式得到受体的激发吸收比率系数v_A和发射分布系数u_A；所述的和表示分别采用两种不同波段的激发光激发受体样本时在探测通道1和2测量的荧光强度，上标1和2分别表示两种不同波段的激发光，下标1和2分别表示两个探测通道，A表示单转受体样本；其中表示在两种不同波段的激发光激发下受体对应的消光系数；(3)利用供受体浓度比已知的串联质粒校正系统得到校正因子g；所述的校正因子g通过供受体浓度比为1:1的两种质粒来得到；或者通过已知效率的供受体浓度比为1:1的一种质粒得到；(4)待测FRET样本的FRET效率的测量：利用两种不同波段的激发光分别激发待测FRET样本并进行双通道同时荧光成像，得到和通过公式(5)计算得到和再通过公式(6)计算得到δ¹和δ²，最后代入公式(9)计算得到待测FRET样本的表观FRET效率；所述的和表示分别采用两种不同波段的激发光激发FRET样本时探测通道1和2探测的荧光强度，上标1和2分别表示两种不同波段的激发光，下标1和2分别表示两个探测通道，DA表示待测FRET样本；所述的表示FRET样本在激发光i的激发时在两个探测通道上探测到的荧光强度之比，上标i表示激发波段λⁱ，i＝1，2；所述的δi表示在λi激发光的激发下，由于FRET效应导致FRET样本在两个探测通道上的荧光分布系数分别相对供体荧光分布系数减少量和受体荧光分布系数增加量的比值。