[发明专利]一种用于表征鲳鲹巨噬细胞吞噬微生物的系统

摘要

本发明公开了一种用于表征鲳鲹巨噬细胞吞噬微生物的系统，通过手术刀和镊子对鲳鲹进行解剖并分离得到其头肾，通过细胞筛摩擦头肾得到含巨噬细胞的细胞悬液，通过Percoll溶液密度梯度离心管，得到头肾的巨噬细胞。通过台盼蓝染色手段对其体外培养的细胞存活数量进行计数，并且检测其一周内的存活状况。通过该系统进行吞噬实验，测定卵形鲳鯵头肾巨噬细胞对鰤鱼诺卡氏菌和酵母等的吞噬情况，以观察其吞噬功能。通过使用该系统的实验结果可以发现，本发明能够良好地提取鲳鲹巨噬细胞，并能够良好地观察鲳鲹巨噬细胞的存活情况与吞噬情况。本发明为进一步研究鲳鲹巨噬细胞的生理学、病理学、毒理学奠定了基础。

主权项

1.一种用于表征鲳鲹巨噬细胞吞噬微生物的系统，其特征在于，所述用于表征鲳鲹巨噬细胞吞噬微生物的系统包括如下部件：载玻片，所述载玻片是用无水乙醇洗涤过的显微镜载玻片；蜡笔，所述蜡笔用于在所述载玻片上干净的区域上圈画一直径约1.5cm的圆形区域；第一吸管，所述第一吸管用于在所述圆形区域滴加50μL浓度为2×106细胞/ml的巨噬细胞悬液；第一培养皿，所述第一培养皿内设有湿润滤纸并有盖，所述第一培养皿用于将所述圆形区域中的所述巨噬细胞悬液在25℃条件下培养1‑2小时；第二吸管，所述第二吸管用于在25℃条件下吸取L‑15以洗涤经所述第一培养皿处理后的所述载玻片；第三吸管，所述第三吸管用于以巨噬细胞：微生物细胞为1:10的比例将50μl所述微生物细胞悬液加入经所述第二吸管处理后的所述圆形区域；第二培养皿，所述第二培养皿内设有湿润滤纸并有盖，所述第二培养皿用于在25℃条件下培养经所述第三吸管处理后的载玻片60min；第四吸管，所述第四吸管用于吸取磷酸盐缓冲液或L‑15洗涤经所述第二培养皿培养后的载玻片5次；第五吸管，所述第五吸管用于吸取100μl100％甲醇固定经过所述第四吸管处理后的载玻片上的所有细胞5min；第六吸管，所述第六吸管用于吸取70％甲醇以冲洗经所述第五吸管处理后的载玻片5次；第七吸管，所述第七吸管用于吸取迪夫快速染色液并滴加到经所述第六吸管处理后的载玻片上的所述圆形区域；第八吸管，所述第八吸管用于吸取封片剂并将其滴加到经所述第七吸管处理后的载玻片上；盖玻片，所述盖玻片用于盖在经所述第八吸管滴加了封片剂并风干后的载玻片上；第一显微镜，所述第一显微镜用于观察计数已经盖上盖玻片的载玻片上巨噬细胞吞噬细菌的情况；所述鲳鲹巨噬细胞是使用下面的部件获取的鲳鲹巨噬细胞：手术刀，所述手术刀用于剖开鲳鲹的腹部；第一镊子，所述第一镊子用于取出经所受手术刀剖开的所述鲳鲹的头肾；冰块；细胞筛，所述细胞筛是无菌的100目细胞筛；第三培养皿，所述第三培养皿是装有含有20i.u./ml肝素的5ml L‑15培养基的培养皿；第二镊子，所述第二镊子用于：当所述第三培养皿位于所述冰块上且所述细胞筛位于所述第三培养皿上的条件下，夹持所述头肾并在所述细胞筛的网格上摩擦所述头肾，使所述头肾细胞落入所述第三培养皿中形成细胞悬液；Percoll梯度离心管，所述Percoll梯度离心管的上部为34％Percoll层，下部为51％Percoll层；第十六吸管，所述第十六吸管用于将所述第三培养皿中形成的细胞悬液转移到所述Percoll梯度离心管的34％Percoll层；第一离心机，所述第一离心机用于在4℃，400g条件下，离心经所述第十六吸管处理后的Percoll梯度离心管25分钟；第十七吸管，所述第十七吸管用于吸取并弃去经所述第一离心机离心的所述Percoll梯度离心管中的上层34％Percoll液体；第四离心管；第十八吸管，所述第十八吸管用于将经所述第十七吸管处理后的所述Percoll梯度离心管中34％Percoll/51％Percoll界面处的细胞悬液层吸取并注入含有L‑15的所述第四离心管；第二离心机，所述第二离心机用于在4℃，2000rpm条件下离心经所述第十八吸管处理后的所述第四离心管7min；第十九吸管，所述第十九吸管用于吸取并弃去经所述第二离心机处理的所述第四离心管中的上清；第二十吸管，所述第二十吸管用于向经所述第十九吸管处理的所述第四离心管加入1ml灭菌双蒸水轻柔冲洗细胞15‑30s；第三离心机，所述第三离心机用于在4℃，2000rpm条件下离心经所述第二十吸管处理的所述第四离心管7mim；第二十一吸管，所述第二十一吸管用于吸取并弃去经所述第三离心机处理的所述第四离心管中的上清；所述用于表征鲳鲹巨噬细胞吞噬微生物的系统还包括：第二十八吸管，所述第二十八吸管用于将L‑15培养基注入经所述第二十一吸管处理的所述第四离心管以重悬细胞沉淀形成巨噬细胞悬液；第二血球计数板；第二十九吸管，所述第二十九吸管用于将经所述第二十八吸管处理所得到的巨噬细胞悬液滴加到所述第二血球计数板；第二显微镜，所述第二显微镜用于观察经所述第二十九吸管处理的所述第二血球计数板以计数所述鲳鲹巨噬细胞；第三十吸管，所述第三十吸管用于依据通过所述第二显微镜观察并计算出的鲳鲹巨噬细胞浓度，将二者浓度均为每100mlL‑15培养基中100i.u的含钾青霉素/链霉素硫酸盐的L‑15培养液稀释加入经所述第二十八吸管处理的所述第四离心管以将其中的所述巨噬细胞悬液调整细胞浓度为1×107细胞ml‑1；细胞培养板或细胞瓶；第三十一吸管，所述第三十一吸管用于将经过所述第三十吸管处理的所述细胞悬液注入所述细胞培养板或细胞瓶以在无血清L‑15培养液中25℃条件下培养2h；三十二吸管，所述第三十二吸管用于待所述头肾巨噬细胞贴壁后，吸取并弃去经所述第三十一吸管处理后所述细胞培养板或细胞瓶中的无血清L‑15培养液；第三十三吸管，所述第三十三吸管用于向经所述第三十二吸管处理的所述细胞培养板或细胞瓶注入含10％小牛血清FCS、含钾青霉素/链霉素硫酸盐的L‑15培养液。