[发明专利]基于ICAM-1信号通路的高通量药物筛选模型的建立方法

摘要

本发明属于药物分子模型构建技术领域，具体涉及一种基于ICAM‑1信号通路的高通量药物筛选模型的建立方法。ICAM‑1为重要免疫系统元件，是诸多疾病的重要表征分子。本发明聚焦ICAM‑1分子及其调控网络，以工程化酵母为媒介构建新型药物筛选系统，在酵母表面展示ICAM‑1高亲和性受体LFA‑1插入结构域并在其胞内表达绿色荧光蛋白。药物如作用于ICAM‑1及其信号途径，将影响酵母细胞与单位动物细胞结合数量，通过荧光强度差异可以快速筛选药物，可用酵母荧光强度指示而达到对ICAM‑1表达量的高效、简便、经济高通量药物筛选。本发明的可塑性高，可根据不同疾病类型动物细胞建立各自相应药物筛选平台。

主权项

1.一种基于ICAM-1信号通路的高通量药物筛选模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)工程化酵母的构建和验证：在启动子GAL10的后面依次连接分泌信号肽SS、α-半乳糖苷酶Aga2基因、人LFA-1 αL I domain基因和Flag标签，使人LFA-1 αL I domain胞外域、Flag标签和α半乳糖苷酶Aga2基因的N端到C端区域同时展示于EBY100酵母细胞的表面；在启动子GAL1的后面依次连接有GFP荧光蛋白基因和Myc标签，使其能够在酵母细胞的胞内表达GFP绿色荧光蛋白，用于指示酵母数量，得到双通道蛋白表达工程酵母的质粒载体pDV3-intre-huαL Idwt-wGFP，pDV3-intre-huαL Id D137A-wGFP和pDV3-intre-huαL Id F265S/F292G-wGFP；所述的启动子GAL10的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述的分泌信号肽SS的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；所述的α-半乳糖苷酶Aga2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；所述的人LFA-1 αL I domain基因为三个，即wt、D137A、F265S/F267G，其中wt的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，D137A的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；F265S/F267G的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述的Flag标签的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；所述的启动子GAL1的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；所述的GFP荧光蛋白基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示；所述的Myc标签的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；所述的双通道蛋白表达工程酵母的质粒载体pDV3-intre-huαL Idwt-wGFP的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示；pDV3-intre-huαL Id D137A-wGFP的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示；pDV3-intre-huαL IdF265S/F292G-wGFP的核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示；将所述的三个双通道蛋白表达工程酵母的质粒载体pDV3-intre-huαL Idwt-wGFP、pDV3-intre-huαL Id D137A-wGFP和pDV3-intre-huαL Id F265S/F292G-wGFP以PEG/LiAc方法和一个质粒载体对应一个酵母细胞方式分别导入酵母细胞EBY100中，得到三个重组酵母细胞，培养这三个重组酵母细胞并诱导表达，得到表面展示有目标蛋白的酵母细胞后，用流式细胞仪检测人LFA-1 αL I domain和GFP荧光蛋白是否表达；(2)哺乳动物细胞炎症模型的构建和验证：将人微血管内皮细胞HMEC-1接种到细胞培养板中，待细胞长至80％时经细菌脂多糖(LPS)诱导3h后，用qRT-PCR方法检测ICAM-1基因的表达量；诱导12h后用抗ICAM-1单克隆抗体LB-2通过流式细胞仪检测ICAM-1蛋白的表达量；同时用1μM的雷公藤红素处理3h后，再经LPS诱导3h后用qRT-PCR检测炎症因子基因MCP-1、ICAM-1、VCAM-1和E-selectin的表达量，诱导12h后用抗ICAM-1单克隆抗体LB-2通过流式细胞仪检测ICAM-1蛋白的表达量；(3)高通量药物筛选模型的构建和验证：以1uM雷公藤红素作为抗炎活性检测的阳性药物，将HMEC-1细胞接种到细胞培养板中，当HMEC-1细胞生长至80％时，加入1μM雷公藤红素处理3h，加入1ug/ml的LPS，诱导12h后，加入适量的表达LFA-1hu aL I domain蛋白和GFP蛋白的EBY100酵母细胞，在室温下于120rpm/h动态结合1h，用PH为7.4的缓冲溶液B洗涤3遍后，在光学显微镜下观察每个处理组的酵母细胞数，在荧光显微镜下观察每个处理组EBY100酵母细胞与HMEC-1细胞的结合情况；用酶标仪统计每孔荧光强度；用1μM的地塞米松、100μg/ml的氢化可的松并参照上述雷公藤红素的处理步骤再处理一遍；以未经LPS处理的HMEC-1细胞与Wt、D137A不敏感型酵母细胞为对照；其中：所述的缓冲液B配比如下：磷酸盐缓冲液(PBS)+0.5％牛血清白蛋白+10mM MgCl2。