[发明专利]基于ICAM-1信号通路的高通量药物筛选模型的建立方法

说明书

本发明属于药物分子模型构建技术领域，具体涉及一种基于ICAM‑1信号通路的高通量药物筛选模型的建立方法。ICAM‑1为重要免疫系统元件，是诸多疾病的重要表征分子。本发明聚焦ICAM‑1分子及其调控网络，以工程化酵母为媒介构建新型药物筛选系统，在酵母表面展示ICAM‑1高亲和性受体LFA‑1插入结构域并在其胞内表达绿色荧光蛋白。药物如作用于ICAM‑1及其信号途径，将影响酵母细胞与单位动物细胞结合数量，通过荧光强度差异可以快速筛选药物，可用酵母荧光强度指示而达到对ICAM‑1表达量的高效、简便、经济高通量药物筛选。本发明的可塑性高，可根据不同疾病类型动物细胞建立各自相应药物筛选平台。

技术领域

本发明属于药物分子模型构建技术领域，具体涉及一种基于ICAM-1信号通路的高通量药物筛选模型的建立方法。

背景技术

炎症是机体对各种致炎因素及其所产生损伤的防御反应,但过度的炎症反应也会对机体造成损伤(Kleiman A和Tuckermann JP，2007；Cohen J，2002)。目前临床上常用的抗炎药主要有两类:非甾体抗炎药和甾体类抗炎药。虽然这两类抗炎药都有一定的临床抗炎效果,但长期大量使用也会产生一系列不良反应,如胃粘膜、肝脏、肾脏损害等。天然药物具有来源广、造价低、副作用小等特点,随着对天然药物研究的不断深入,部分天然药物的抗炎作用已经得到认可，寻找低毒高效的新型天然抗炎药物是当前的研究热点之一。

酵母表面双杂交系统，是通过分泌途径来分析蛋白互作的一个平台，这种系统是在酵母表面展示系统的基础上发展起来的，优点在于无需蛋白表达纯化，在酵母体内同时表达这两个蛋白并最终展示于酵母表面。在YSD基础上酵母表面展示一个外源蛋白X，另一个蛋白Y则以分泌的形式表达，如果X能结合Y，那么Y则可以与X一起附于酵母表面，利用Y或与Y融合的寡肽的抗体来检测他们的亲和性，并且X和Y之间的亲和性可以通过流式细胞仪定量(Hu,.et al.,2009)。这种技术的创新性在于：①首创Gall和Gall0启动子的联用。②建立利用酵母蛋白分泌途径的蛋白-蛋白相互作用体系。③本系统无需蛋白纯化即可进行蛋白的定向进化以及文库受体筛选。

ICAM-1与其受体LFA-1是免疫系统的重要成员。ICAM-1是免疫系统炎症反应的重要分子基础，属于免疫球蛋白超级家族成员之一，蛋白分子量为90kDa，含有5个免疫球蛋白超级家族结构域；ICAM-1通常仅低水平表达于内皮细胞或者其他类型细胞，而细胞因子以及活性氧等激发下通过PKC以及NF-kB等信号途径高水平表达(Long,2011；Rahman和Fazal,2009)。淋巴细胞功能相关抗原-1(lymphocyte function associated antigen-1,LFA-1)属于整合素家族,整合素是一类重要的细胞黏附分子,是由α和β两个亚基通过非共价键组成的异源二聚体,整合素可以通过其胞内区与胞内的细胞骨架蛋白和信号分子结合,通过由内到外(inside-out)和由外到内(outside-in)双向传递跨膜信号(Abrams P和MarshJW，2010；Zhu J,2007；Arnaout M,2005)。