[发明专利]一种白鹤芋四倍体的诱导方法

摘要

一种白鹤芋四倍体的诱导方法，以二倍体健壮组培苗的茎尖芽体作为外植体诱导带芽的愈伤组织，采用二倍体健壮组培苗可稳定地获得大量诱导材料，缩短诱导材料的准备时间，并且可以减少污染，并且用二倍体健壮组培苗的茎尖芽体作为外植体诱导的愈伤组织作为处理材料，其具有芽体活性强，易于增生和分化，重复性好等优点。

主权项

1.一种白鹤芋四倍体的诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：1)选取二倍体生长旺盛，叶色翠绿，株高1.5～3cm，不徒长，不拔节的健壮组培苗植株；2)切取健壮组培苗植株的茎尖芽体，接种于pH值为5.6～5.8的固体诱导培养基中培养30～45天，获得组培苗带芽体的愈伤组织；其中，固体诱导培养基的配方为：MS基本培养基, 6‑苄氨基腺嘌呤（6‑BA）0.8～1.2 mg/L，2,4‑D 0.1～0.5mg/L，白糖25～35g/L，琼脂4～6g/L；3)将愈伤组织接种于pH值为5.6～5.8的固体分化培养基中，预培养4～7天后，再接种于pH值为5.6～5.8的液体分化培养基中浸渍6～10天，并且在液体分化培养基中培养的期间每间隔2天摇匀一次；其中，固体分化培养基的配方为：MS基本培养基, 6‑苄氨基腺嘌呤（6‑BA）0.8～1.2 mg/L，萘乙酸（NAA）0.1～0.3mg/L，白糖25～35g/L，琼脂4～6g/L；液体分化培养基的配方为：MS基本培养基, 6‑苄氨基腺嘌呤（6‑BA）0.8～1.2 mg/L，萘乙酸（NAA）0.1～0.3mg/L，白糖25～35g/L，浓度0.06～0.1% 的秋水仙素；4)将经过步骤3）培养后的愈伤组织取出，经无菌水清洗1～2遍，并用无菌滤纸吸干后，再次接入固体分化培养基中进行分化培养，30～40天后，筛查出芽粗壮、叶片肥厚的植株；其中，本步骤中的固体分化培养基与步骤３）中的固体分化培养基配方一致；5)将指甲油涂抹于步骤4）中筛查出的植株叶片背部，2min后，通过镊子轻轻撕取其表面组织，并将该表面组织置于载玻片上，盖上盖玻片，进行镜检；6)将镜检得出的气孔大小大于正常气孔10～50%的表面组织筛选出来，并将与该表面组织相对应的植株接种于生根培养基中培养，待该植株的根长生长到0.5～2cm时进行根尖染色体筛查；其中，生根培养基的配方为：1/2MS基本培养基, 萘乙酸（NAA）0.1～0.3mg/L，白糖25～35g/L，琼脂4～6g/L，活性炭（AC）0.1～0.3%；7)在无菌操作条件下，切取已生根的植株0.4～0.8cm的根尖，并进行小苗与根尖编号；8)在16～20℃的黑暗条件下，将根尖用0.002M的8‑羟基喹啉处理液进行预处理6～8h，期间每隔2h换一次0.002M的8‑羟基喹啉处理液；9)将预处理后的根尖用清水洗净，并于3～5℃条件下用新鲜配制的卡诺固定液固定18～24h，该卡诺固定液的配比为95%乙醇：冰醋酸=3:1；10)将卡诺固定液中的根尖取出，并在50～60℃条件下，将其依次用1M HCl酸解4～6min，蒸馏水水洗3～4次，漂洗1.5～3h，最后切取根尖分生区，并置于载玻片上将其捣碎，蘸取0.025%甲基紫1～2滴于根尖捣碎区，染色2～3min，盖上盖玻片，用橡皮擦轻压成雾状分散形态；11)将步骤10）中做好的载玻片根尖在显微镜下镜检，将染色体数为52条的植株进行编号和数量记录统计。