[发明专利]一种体外IAK免疫细胞培养方法

摘要

本发明属于肿瘤预防和治疗技术领域，具体涉及一种优化的体外IAK免疫细胞培养方法。该方法包括：提取外周血单个核细胞，然后随培养时间不同分步骤、分批次加入特殊设计的A、B、C、D试剂，并培养至特定时间等步骤。本发明通过对IAK免疫细胞体外培养体系进行优化，使得该技术在细胞扩增能力、效应细胞表型及比例、杀伤能力等指标方面保持一致或有了较好改进，尤其是效应细胞比例、效应细胞的杀伤能力有了明显改善，从而使得该技术能够更好的用于肿瘤治疗，因而具有较好的实用价值和推广应用意义。

主权项

1.一种体外IAK免疫细胞培养方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：（1）提取外周血单个核细胞，具体为：采集肿瘤患者外周血，离心，取沉淀细胞，同时将上清液，即自体血清，灭活备用；沉淀细胞用生理盐水重悬后置于淋巴细胞分离液上，进行密度梯度离心，收集单个核细胞并用生理盐水冲洗干净备用；（2）体外细胞培养，具体为：第0天：将步骤（1）所获得的单个核细胞，按每2×10⁶个细胞加淋巴细胞培养基1mL的比例，加入淋巴细胞培养基；然后加入A试剂，再加入步骤（1）中灭活后上清液，进行培养；所述A试剂为溶解有IL‑2和GM‑CSF的淋巴细胞培养基，IL‑2的浓度为100U/μL，GM‑CSF的浓度为100U/μL；第2天：再次加入A试剂；第4天：吹打细胞并进行扩增，加入淋巴细胞培养基后，再加入A试剂及步骤（1）中灭活后上清液；第5天：加入B和C试剂；所述B试剂为溶解有7DW8‑5的淋巴细胞培养基，其中7DW8‑5的浓度为1ng/μL；所述C试剂为溶解有IFN‑γ、IL‑2 和CD3单抗的淋巴细胞培养基，其中IFN‑γ的浓度为100U/μL，IL‑2的浓度为200U/μL，CD3单抗的浓度为5ng/μL；第7天：吹打细胞进行扩增，加入淋巴细胞培养基后，然后加入D试剂，再加入步骤（1）中灭活后上清液；所述D试剂为溶解有IL‑2的淋巴细胞培养基，其中IL‑2的浓度为100U/μL；第10天：重复“第7天”的操作步骤，以对细胞进行进一步扩增；第13~14天：收集细胞，检测细胞免疫表型和杀伤功能，从而对培养结果做出评价；A试剂加入量10μL/mL；B试剂加入量5~10μL/mL；C试剂加入量10μL/mL；D试剂加入量10μL/mL；所述淋巴细胞培养基为GT‑T551无血清培养基；自体血清加入量为5%体积比。