[发明专利]一种利用液相色谱串联质谱检测血浆中儿茶酚胺的方法

摘要

本发明公开了一种利用液相色谱串联质谱检测血浆中儿茶酚胺的方法，包括步骤：标准品制备，液相色谱分离，质谱检测并制标准曲线，血浆中儿茶酚胺的检测。本发明的方法创新性地应用高通量液相色谱串联三重四级杆质谱仪进行儿茶酚胺的检测，具有以下有益效果：采用乙腈进行蛋白沉淀，丹磺酰氯进行衍生化反应，提取后使用液相色谱串联三重四级杆质谱仪检测，前处理步骤简单，可以有效去除血浆基质干扰，特异性好；通过丹磺酰氯衍生化后，能有效提高检测灵敏度；高通量液相色谱串联质谱仪进行检测，同时定性并精准定量血浆中包括多巴胺，肾上腺素，去甲肾上腺素的3种儿茶酚胺，检测时间短，通量高，检测灵敏度高，特异性好，成本低廉。

主权项

1.一种利用液相色谱串联质谱检测血浆中儿茶酚胺的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)标准品制备：分别取若干不同浓度的儿茶酚胺乙腈溶液，分别加入等量的含已知浓度内标的乙腈溶液，备用；在避光条件下，利用衍生化试剂丹磺酰氯对加入内标的儿茶酚胺乙腈溶液，进行衍生化处理使得儿茶酚胺发生化学反应，以提高儿茶酚胺在质谱上的信号响应；衍生化试剂丹磺酰氯具体为：4mg/mL的丹磺酰氯乙腈溶液和0.1M pH＝11.0的Na2CO3–NaHCO3缓冲溶液按体积比为3:1的混合溶液，衍生化反应条件为：35℃避光反应30min；反应完后加入甲酸水溶液调节使pH＝7，离心后取样品上清液于96孔板上备用，用于液相色谱串联质谱上样分析，完成标准品的制备；2)液相色谱分离：利用超高压液相色谱以及相应的流动相，在反向C18分析柱上对标准品中儿茶酚胺进行色谱洗脱分离，通过控制洗脱条件，分离出肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺；液相色谱条件为：色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18Column:pore sizeparticle size 1.7μm,2.1mm×50mm；cat.#186002350IVD；色谱柱柱温：25℃；进样量：15μl；流速：0.3ml/min；流动相组成：A相：20mM醋酸铵和0.1％甲酸水溶液，体积分数，B相：0.1％甲酸-乙腈溶液，体积分数；3)质谱检测并制标准曲线：液相色谱上分离出的3种儿茶酚胺进入到三重四级杆质谱进行检测，利用三重四级杆质谱中的多重反应监控模式特异性地检测3种儿茶酚胺的含量，根据信号噪音比计算得到定量检测限与鉴定检测限，根据比值以及已知标准品和内标浓度值绘制标准曲线图并得到定量校正方程；4)血浆中儿茶酚胺的检测：取血浆样本，加入含已知浓度内标的乙腈溶液进行蛋白沉淀，充分沉淀后第一次离心，移取血浆上清液并进行冷冻干燥；在避光条件下，利用衍生化试剂丹磺酰氯对血浆上清液进行衍生化处理使得儿茶酚胺发生化学反应，以提高儿茶酚胺在质谱上的信号响应；衍生化试剂丹磺酰氯具体为：4mg/mL的丹磺酰氯乙腈溶液和0.1M pH＝11.0的Na2CO3–NaHCO3缓冲溶液按体积比为3:1的混合溶液，衍生化反应条件为：35℃避光反应30min；反应完后加入甲酸水溶液调节使pH＝7，第二次离心后取样品上清液于96孔板上备用，用于液相色谱串联质谱上样分析；液相色谱串联质谱分析同步骤2)和3)，质谱检测得到儿茶酚胺与内标的比值，将比值代入到定量校正方程，计算得到血浆中儿茶酚胺的含量。