[发明专利]一种快速高效的农杆菌介导的烟草种子遗传转化方法

摘要

本发明公开一种快速高效的农杆菌介导的烟草种子遗传转化方法。该方法的主要步骤包括：成熟烟草种子经适度研磨后用作遗传转化材料，调整农杆菌菌液浓度至适当值以用于侵染受体材料，依次经共培养、播种、GUS组织化学染色和PCR扩增后，鉴定转基因烟草植株。本发明方法无需进行消毒、灭菌和组织培养等步骤，且大部分操作过程无需在无菌条件下进行，避免了由于无菌和组培操作带来的繁琐、耗时等缺点，是一种简单、快捷、成本低、重复性较好的遗传转化方法，对于快速创制转基因烟草新种质具有重要的意义和价值。

主权项

1.一种快速高效农杆菌介导的烟草种子遗传转化方法，采用以下步骤：1)选取饱满的种子为实验材料，用研磨杵研磨种子破坏种皮从而裸露其胚即可；2)调整含有目标载体的工程农杆菌菌液至适当浓度，结合真空渗透法，将农杆菌导入烟草的胚细胞；3)无菌滤纸吸取多余菌液后，将侵染后的种子播于培养基中于28℃暗条件培养2d；4)将烟草种子移入适宜生长的土壤，对其进行常规管理，至其长到3‑4叶期进行转基因烟草植株鉴定、筛选；所述步骤3)中的培养基为去糖MS液体培养基；所述步骤1)中的种子为收集的成熟烟草种子，于40℃烘干备用；所述烟草种子进行遗传转化前，均无需消毒处理；所述步骤2)中的真空渗透法为将裸露出胚的烟草种子用无菌的超纯水重悬农杆菌菌液浸泡，抽真空处理；所述抽真空处理的条件为：15Kpa压强下浸泡8‑10min；所述重悬液中农杆菌菌液其OD₆₀₀为0.3‑0.5；所述农杆菌菌液中加入乙酰丁香酮AS和表面活性剂Silwet L‑77。