[发明专利]CYP71Z18基因及其编码蛋白与应用

摘要

本发明公开了一种CYP71Z18基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还公开了一种CYP71Z18基因的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明还公开了一种CYP71Z18基因的编码蛋白在调节和生产植物二萜类化合物及水稻育种中的应用。本发明有助于利用CYP71Z18催化特性在工业上生产多种新的二萜类化合物，以及对改造水稻二萜类化合物的合成途径等具有重要理论及实践意义。

主权项

1.一种CYP71Z18基因的编码蛋白在调节和生产植物二萜类化合物中的应用，其特征在于，包括以下步骤：将pGGsC/pGGeC、pDEST14‑OsKSL与pCDF‑AtCPR1‑CYP71Z18三种重组质粒各100‑150ng同时加入40μL大肠杆菌C41(DE3)感受态细胞中，冰浴20min，42℃热激1min30s，冰上冷却2min后加入液体LB培养基200μL复苏2h，再涂布于同时含有氯霉素50mg/L、硫酸卡那霉素50mg/L和盐酸壮观霉素50mg/L的固体LB培养基平板上；37℃过夜培养，第二天挑选平均菌落，置于同时含有氯霉素50mg/L、硫酸卡那霉素50mg/L和盐酸壮观霉素50mg/L的5mL液体LB培养基中，37℃，过夜摇菌制备得到6种菌种；这些菌种为大肠杆菌C41(DE3)背景株系，且每个菌种分别含有三种质粒：①pGGsC，pDEST14‑OsKSL4，pCDF‑AtCPR1‑CYP71Z18；②pGGsC，pDEST14‑OsKSL8，pCDF‑AtCPR1‑CYP71Z18；③pGGsC，pDEST14‑OsKSL10，pCDF‑AtCPR1‑CYP71Z18；④pGGsC，pDEST14‑OsKSL11，pCDF‑AtCPR1‑CYP71Z18；⑤pGGeC，pDEST14‑OsKSL7，pCDF‑AtCPR1‑CYP71Z18；⑥pGGeC，pDEST14‑OsKSL10，pCDF‑AtCPR1‑CYP71Z18；次日取1mL菌种置于50mL TB液体培养基，培养基中加入相应的抗生素，37℃，200rpm培养，菌液养至A₆₀₀达到0.8‑1.0，向其中加入1mM异丙基‑β‑D‑硫代吡喃半乳糖苷诱导表达，并在诱导表达时加入细胞色素P450反应所需辅因子75mg/Lδ‑氨基乙酰丙酸，1mM硫胺素，5mg/L核黄素；然后转至16℃，200rpm诱导培养72h；72h后用等体积的正己烷萃取萜类产物；所有的产物都经过叠氮甲烷甲基化后用于GC‑MS检测羧酸类产物，制备得到羧酸类产物；所述液体LB培养基具体为：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g，去离子水1L，用1mol/L的NaOH调PH值至7.0；高压灭菌，4℃保存；固体LB培养基在灭菌前加上15g/L的琼脂；所述TB液体培养基具体为：NaCl 5g，MgSO₄.7H₂O 2g，酵母提取物24g，水解酪蛋白12g，甘油20mL，去离子水900mL；10×TB缓冲液：KH₂PO₄2.31g，K₂HPO₄12.54g，去离子水100mL；高压灭菌，4℃保存，使用时加入10×TB缓冲液100mL。