[发明专利]一种海水微生物宏基因组的提取方法

摘要

本发明提供一种海水微生物宏基因组的提法方法。本发明针对海水这一特殊的样本给予去盐离子处理、双重滤膜过滤再回收处理相结合，旨在提供一种高效、快速的提取海水微生物宏基因组的方法，具体包括以下几个步骤：海水中杂质的去除、海水微生物的裂解、DNA的游离与吸附、DNA洗脱。本发明能够有效的去除海水中较多的盐离子的干扰；充分裂解海水中的微生物细胞，使DNA充分释放。本发明方法提取的DNA，其A260/280比值维持在1.8‑2.0之间，所得DNA质量好、纯度高；能够满足基因文库构建和qPCR以及高通量测序的需求，为研究微生物基因组遗传变异多样性提供了良好的基础。

主权项

1.一种海水微生物宏基因组的提取方法，其特征在于：所述提取方法包括如下步骤：海水中杂质的去除、海水微生物的裂解、DNA的游离与吸附、DNA洗脱;具体包括如下步骤：（1）海水中杂质的去除：海水样本中按照2 % 的质量体积比加入α‑纤维素，常温下，静置0.5 h；将0.8 um的滤膜安装于已灭菌的过滤器上，连接好负压泵，将海水样本倒入过滤器上方，打开负压泵电源，执行过滤；然后更换0.2 um的滤膜对滤液进行再次过滤；把两种滤膜都进行收集；将回收的滤膜迅速置于液氮中冻存1 min，然后置于室温下90 s，如此反复冻融5次；（2）海水微生物的裂解：将滤膜剪碎置于5 ml离心管中，再加入250 μl细胞裂解液、40 μl浓度为20 mg/ml的溶菌酶以及10 μl浓度为2 mmol/L的EDTA；将反应液置于56 ℃水浴锅中孵育10 min，期间每隔5 min震荡一次；然后把样品放入均质分散机中，设定程序5 min、120000 g离心15 min；取上清至干净的2 ml离心管中；所述细胞裂解液成分为：150 mmol/L NaCl、1% vol的NP‑40、0.5% w/v的脱氧胆酸钠、0.1% w/v的SDS和50 mmol/L的Tris，pH=8.0；（3）DNA的游离与吸附：往上清液中加入250 μl浓度为10 mg/kg的蛋白酶k溶液，用枪头混匀；120000g离心5min，然后小心取上清至新的2 ml离心管中；往离心管中加入等体积的酚:氯仿:异戊醇=25:24:1进行抽提；14000 g离心3 min，将上清转移至吸附柱中；将吸附柱置于离心管中，14000 g离心5 min，弃掉收集管中的废液；(4)DNA洗脱：往离心柱中加入70%的乙醇750 μl，然后12000 g离心3 min，弃收集管中的废液；再次加入等体积的70%乙醇，14000 g离心5 min，弃掉收集管中的废液；然后加入成分为10 mmol/L的Tris‑Cl、1 mmol/L的EDTA、pH=8.0的DNA洗脱液80 μl；14000 g离心5 min，收集离心管中的DNA洗脱液，测定浓度。