[发明专利]一种黄鳝基因编辑的方法

摘要

本发明公开了一种黄鳝基因编辑的方法，其步骤：1，通过建立室内黄鳝全人工繁殖技术，获得人工授精的黄鳝1细胞期胚胎。2，构建靶基因的类转录激活样效应因子核酸酶基因编辑载体，体外转录合成mRNA后，采用显微注射方法导入黄鳝1细胞期的受精胚中。3，靶基因发生突变的黄鳝可通过三引物检测方法筛选获得，并可通过测序确定靶基因的突变类型。该方法是第一次建立黄鳝胚胎的显微操作技术，第一次建立黄鳝内源基因精准编辑技术，为开展黄鳝基因的功能研究和黄鳝养殖品种的遗传改良提供了强有力的技术手段。

主权项

1.一种黄鳝基因编辑的方法，其步骤是：1).构建靶基因的TALENs载体：确定基因编辑靶点序列以及其左右臂的识别序列，利用Golden Gate克隆方法制备TA LENs左臂表达质粒和TALENs右臂表达质粒，体外转录成TALENs mRNA后保存；2).显微注射黄鳝1细胞期的胚胎靶基因的左右臂混合后的终浓度为100ng/μL，利用显微注射注射到黄鳝1细胞期受精卵的动物极中，每枚受精卵注射体积为2nL；黄鳝1细胞期受精胚的制备过程包括：在室内养殖系统中进行黄鳝人工催产繁殖，雌鳝的注射剂量为按每100g雌鳝体重同时注射3mg的鲤鱼脑垂体、10μg的促黄体素释放激素A2和500IU的绒毛膜促性腺激素；雌鳝注射24h后，雄鳝按5μg/100g体重注射LHRH‑A2；雌鳝注射40h后，挤出卵子；同时获取雄鳝精子，精子置于Danieal缓冲液中后立即倒入卵子，轻轻摇动混匀，静置5min完成受精过程；曝气水洗去杂质，就可获得黄鳝1细胞期的受精胚；所述的雌鳝的规格为50‑100g；所述的雄鳝的规格为>200g；3).筛选靶基因突变的黄鳝将显微注射后的黄鳝受精胚转移至玻璃培养皿室温静置孵化，Danieal缓冲液孵化4天后，更换为曝气水孵化，直到幼苗孵化出膜；将显微注射后的黄鳝养至三个月，利用三引物检测方法，筛选靶基因发生突变的黄鳝；所述的Danieal缓冲液为：1.74mol/L NaCl,0.02mol/L KCl,0.01mol/L MgSO₄·7H₂O,0.02mol/L Ca(NO₃)₂·4H₂O,0.15mol/L Hepes,pH 7.2。