[发明专利]一种基于氧化石墨烯光活化辣根过氧化物酶的免疫分析方法

摘要

本发明提供了一种基于氧化石墨烯光活化辣根过氧化物酶(HRP)的免疫分析检测方法。氧化石墨烯在光照下可以产生活性中间体光生空穴和超氧阴离子自由基，使HRP在没有H2O2的存在下能够催化氧化色原底物。以甲胎蛋白(AFP)为模型物，通过DNA杂交链式反应以放大信号，通过氧化石墨烯的光活化HRP作用实现底物的催化氧化，以实现免疫检测。本发明将纳米材料和天然酶的优势相结合，使得AFP的检测限达到0.0001pg/mL。本发明不仅提供了一种新型的通过光激励的纳米材料调控HRP活性的方法，同时为超灵敏的酶联免疫分析法提供了一种新途径。

主权项

1.一种基于氧化石墨烯光活化辣根过氧化物酶的免疫分析方法，其特征在于：a、氧化石墨烯纳米材料的制备：0℃冰浴条件下，将0.5g石墨原料与0.5g NaNO3置于16.5mL的98％H2SO4中，室温下持续搅拌24h；随后在冰浴中保持10分钟，将3g KMnO4缓慢加入到混合物中，持续搅拌1h；在一定温度下继续搅拌一定时间后加入40mL去离子水；最后加入1400mL去离子水和30％H2O2来终止反应；产物经过滤，经5％HCl多次洗涤并置于50℃烘箱烘干；b、在Au纳米粒子上固定甲胎蛋白二抗抗体和碱基序列为5'‑SH‑(CH2)6‑AAAAAAGAAGGAGGGGCGACT‑3'的捕获DNA1，形成Au NPs/Ab2/DNA1复合物，作为信号标签诱导检测信号的产生；Au NPs/Ab2/DNA1复合物的制备方法如下：100mL 0.01％HAuCl4溶液在剧烈搅拌下煮沸，然后快速加入2.5mL 1％的柠檬酸三钠溶液；当溶液的颜色由黄色转变为酒红色，继续搅拌冷却至室温得到Au纳米粒子；将40μL浓度为0.1mg/mL的甲胎蛋白二抗抗体与1.0mL Au纳米粒子在室温下混合搅拌2h，然后加入捕获DNA1，静置过夜后用牛血清白蛋白溶液将非活性位点进行封闭，12000rpm下离心洗涤三次，并重新分散于200μL 1％牛血清白蛋白溶液中；c、以甲胎蛋白为模型物，检验了该方法的测定效果：将20μL 0.1mg/mL的甲胎蛋白一抗抗体固定于96孔板中，经过洗涤以及牛血清白蛋白溶液封闭后加入抗原甲胎蛋白使其充分发生免疫反应，随后96孔板中依次加入25μL的Au NP/Ab2/DNA1复合物，30μL浓度为5μM的生物素标记的碱基序列为5'‑biotin‑(CH2)6‑GGGGCGACTTGAAACAGTCGCCCCTCCTTC‑3'的DNA2，浓度为5μM的碱基序列为5'‑biotin‑(CH2)6‑GTTTCAAGTCGCCCCGAAGGAGGGGCGACT‑3'的生物素标记的DNA3，亲和素标记的辣根过氧化物酶，孵育洗涤后加入10μL的50mg/L的氧化石墨烯溶液，100μL pH＝3.0的醋酸缓冲溶液和20μL的5mmol/L辣根过氧化物酶的特征底物，40℃条件下置于300W氙灯下用λ≥400nm的可见光照射15min微孔板，用酶标仪测定氧化后的底物的吸收光谱。