[发明专利]一种能够表达ALV-J囊膜蛋白的重组A亚群禽白血病病毒及其构建方法和用途

摘要

本发明公开了一种能够表达ALV‑J囊膜蛋白的重组A亚群禽白血病病毒及其构建方法和用途，本发明以ALV‑A感染性克隆为骨架，将其囊膜蛋白替换为ALV‑J的囊膜蛋白，并在囊膜蛋白3’端携带luciferase报告基因，从而构建得到了能够表达ALV‑J囊膜蛋白的重组ALV‑A病毒的感染性克隆，实验证明，由该感染性克隆拯救得到的重组病毒具有较高的复制能力，病毒滴度达10^5.21TCID50/ml，是ALV‑J原型毒株的125倍，而且携带有luciferase报告基因，易于定量。该重组病毒能侵染表达chNHE1的293T细胞，最早在感染后8h即可检测到病毒，具有较高的敏感性。因此本发明的提出解决了传统ALV‑J病毒毒价低，病毒复制能力不高，以及在病毒感染的早期病毒量较少，不利于检测等问题，对于病毒与其受体的相关研究以及抗ALV‑J抗体检测有重要意义。

主权项

1.一种能够表达ALV‑J囊膜蛋白的重组A亚群禽白血病病毒感染性克隆，其特征在于所述的感染性克隆是以ALV‑A感染性克隆为骨架，将其囊膜蛋白替换为ALV‑J的囊膜蛋白，并在囊膜蛋白3’端携带luciferase报告基因的重组A亚群禽白血病病毒感染性克隆，其中所述的ALV‑A感染性克隆的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述的感染性克隆是通过以下方法构建得到的：(1)将SEQ ID NO.2所示的ALV‑A感染性克隆用KpnⅠ/StuⅠ进行双酶切，胶回收大片段，作为载体骨架片段；(2)以ALV‑J毒株pHPRS103为模板，使用引物PF1/PR1进行PCR扩增，得到包含部分pol基因及整个env基因的片段，将该PCR产物通过ClonExpress^TMII One Step Cloning Kit同源重组于步骤(1)所得到的载体骨架之中，即构建得到表达ALV‑J的囊膜蛋白的质粒命名为pALV‑A(J)，其中，ALV‑J毒株pHPRS103的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；PF1引物 TGATAAGGTTATTTGGGTACCTTCTCGGAAAGTPR1引物 GCTGCCCACAGGCCTCTACAGCTGCTCCCTAATTC(3)用EagⅠ和SalⅠ对pALV‑A(J)质粒进行双酶切，胶回收大片段；以ALV‑A(J)质粒为模板，以PF2/PR2引物对扩增得到片段1；PF2引物 GCAGAATAGTATAAGCGGCCGCTACATGGGTGGTGGTAPR2引物 TTTTTGGCGTCTTCCATGGTGGTCGGCTGCAC(4)以pGL3 Luciferase报告质粒为模板，以PF3/PR3引物对扩增luciferase报告基因，并在其3’端引入SalⅠ酶切位点；PF3引物ATGGAAGACGCCAAAAACATAAA(5)将扩增得到的luciferase报告基因片段与片段1通过重叠延伸PCR融合，与步骤(3)酶切后的大片段连接，得到携带luciferase报告基因的重组A亚群禽白血病病毒感染性克隆。